聚乙二醇干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎早期HBsAg快速下降的臨床及免疫學特征研究

王嘉悅， 李天駒， 付 豪， 秦 波

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一類危害極大的傳染性疾病。近年來，“功能性治愈”這一概念被越來越多的醫務工作者所重視。所謂的“功能性治愈”，也稱“臨床治愈”，是指完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續檢測不到，HBeAg陰轉，伴或不伴HBsAg血清學轉換，殘留cccDNA可持續存在，肝臟炎癥緩解和肝組織病理學改善，終末期肝病發生率顯著降低[1]。雖然“臨床治愈”還不是完全意義上的治愈，但這是一種類似于急性HBV感染自發性清除的狀態，可以實現有效的免疫學控制，是我們目前所追求的理想的治療目標[2]。然而目前指南和專家共識中均認為，這只是部分患者可以達到的目標。因此，需要探索如何讓更多的患者實現這一目標。

聚乙二醇干擾素（Peg-IFN）作為CHB治療的一線用藥，與核苷酸類似物（NA）相比，有著獨特的優勢。有研究表明干擾素治療后HBsAg血清轉陰率高，轉歸好[3]；對于CHB患者來說，以Peg-IFN為基礎的治療比單用拉米夫定療法更能有效地實現HBsAg的清除或血清轉換，且療效優于常規干擾素[4]；對于長期NA不太可能達到治療目標的患者，改用Peg-IFN可以實現較高的HBsAg清除率[5]；接受Peg-IFN治療的HBeAg陰性的CHB患者在停止治療后持續24周的病毒學應答率顯著高于單用拉米夫定者[6]。Peg-IFN既可直接在RNA水平抑制病毒復制，同時也可以作為免疫調節劑發揮作用[7]。同樣有研究報道以Peg-IFN為基礎的聯合治療可以誘導HBV特異性T細胞的恢復[8]；Peg-IFN治療還可顯著地增強CHB患者NK細胞的百分比和功能[9]。同樣地，Shi等[10]研究發現在Peg-IFN治療后功能得到恢復的CD56brihgtNK細胞可以通過TRAIL誘導的細胞溶解和TNF-α/IFN-γ介導的非細胞溶解途徑促進HBsAg和cccDNA清除。有研究還發現具有較低效應記憶γδT細胞比例的CHB患者在Peg-IFNα-2a治療中可能更易獲得應答[11]。綜上可見，宿主免疫功能在Peg-IFN抗HBV治療中發揮著重要作用。

根據《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[1]和《慢性乙型肝炎臨床治愈（功能性治愈）專家共識》[2]的相關內容，我們將“早期應答”定義為：CHB患者在接受Peg-IFN治療24周時，HBV DNA下降＞2 lg IU/mL或治療中HBsAg快速下降（12周或24周時HBsAg＜200 IU/mL或下降＞1 lg IU/mL）。本研究將以接受Peg-IFN治療的HBeAg陰性的CHB患者為研究對象，探索影響早期應答的因素，以及外周血T淋巴細胞的分布及動態變化與Peg-IFN抗HBV療效的相關性，為預測Peg-IFN療效以及尋找新的抗HBV治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究納入2017年4月—2020年8月于重慶醫科大學附屬第一醫院感染科門診就診的CHB患者204例。

納入標準：①成年患者（年齡≥18歲）；②血清HBsAg＜3 000 IU/mL、抗-HBs陽性或陰性、HBeAg陰性、抗-HBe陽性或陰性；③同意使用Peg-IFNα-2b（派格賓）治療，180 μg每周一次，皮下注射，并且堅持每月監測血常規、肝功能，每3個月監測乙肝病毒標志、HBV DNA定量，每半年監測腹部B超、肝臟彈力成像、肝纖譜、甲胎蛋白（AFP）等指標；④已了解本項研究及治療中的風險并簽署知情同意書。

排除標準：①合并其他感染性疾病，如丙型、戊型病毒性肝炎以及HIV感染等；②干擾素治療絕對禁忌證，如：妊娠或短期內有妊娠計劃、精神病史、未能控制的癲癇、失代償期肝硬化、未控制的自身免疫病，嚴重感染、視網膜疾病、心功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病等基礎疾病；③合并心血管、泌尿系統、結締組織及血液系統等嚴重慢性疾病；④使用Peg-IFNα-2b的過程中出現嚴重過敏反應及骨髓抑制等不良反應。

納入符合標準的患者，登記其個人信息及病史，并通過重慶醫科大學附屬第一醫院門診系統獲取患者的檢驗報告，包括血常規、肝功能、乙肝病毒標志、HBV DNA定量、腹部B超、AFP等指標。本研究已通過重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會的審批，審查批號：2020-409。

1.2 樣本采集及處理

采集10名健康志愿者以及納入該研究的部分患者在不同治療階段（基線、12周、24周）的外周血10 mL，通過密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）。細胞計數儀計數，選擇合適的細胞數（不低于2×106/管）分管，梯度凍存（使用程序性凍存盒或4℃，30 min；-20℃，2 h；-80℃，過夜）后于液氮中長期保存。主要試劑有RPMI1640（Gibco）、胎牛血清FBS（Gibco）、人外周血淋巴細胞分離液（TBD公司）、無菌PBS溶液（博士德生物）、無血清細胞凍存液（深圳達科為生物）等。

1.3 流式細胞技術分析T淋巴細胞的分布差異

從液氮罐中取出PBMC，快速復蘇細胞后計數，確保細胞數目不低于2×106/管。再進行Fc封閉：2.5 μL Human TruStain FcX?（ Fc receptor blocking solution） /50 μL細胞體系，避光靜息8 min，免洗，直接用于后續染色。在50 μL PBS溶液重懸的細胞體系中，加入相應的流式抗體，避光孵育20 min，之后 PBS溶液洗滌 2次（離心：300×g，5 min，室溫），最后用400 μL PBS溶液重懸后移入流式管，采用流式細胞儀檢測。數據通過FlowJo軟件進行分析。使用的流式抗體：美國BioLegend公司提供的Human TruStain FcXTM（Fc Receptor Blocking Solution）、PE Anti-Human CD3、PerCP/Cy5.5 Anti-Human CD4、FITC Anti-Human CD8、Brilliant Violet 650TMAnti-Human CD25、APC Anti-Human CD127以及相應的同型抗體Brilliant Violet 650TMMouse IgG1,κ、APC Mouse IgG1,κ。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件及GraphPad Prism 8.0進行作圖和分析。非正態分布資料采用中位數（四分位數）或頻數表示；正態分布數據以均數±標準差表示。臨床資料中，不滿足正態性和方差齊性的組間比較采用非參數秩和檢驗，無序計數資料主要采用χ2檢驗，并應用logistic逐步回歸分析法對早期應答的影響因素進行分析。實驗數據資料中滿足正態分布及方差齊性者，兩組間比較采用非配對t檢驗；兩組間不符合方差齊性者采用Welch's 校正非配對t檢驗；若數據不服從正態分布，則采用Mann-Whitney秩和檢驗。當P＜0.05時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本臨床治療

共納入204例患者，男133例，女71例，曾經接受過NA或IFN治療51例，無NA或IFN抗病毒治療史153例。在這204例患者中，實現早期應答的患者120例，未實現早期應答的患者84例。完成至少48～52周療程的患者137例，其中HBsAg清除的患者66例。而這66例患者中僅有4例未實現早期應答，29例在治療結束時抗-HBs呈陽性（抗-HBs定量＞10 mIU/mL），約為42.06 mIU/mL。所有入組患者在治療期間均使用Peg-IFNα-2b治療，劑量為180 μg，每周1次，皮下注射，并堅持每月門診隨訪。部分患者合并使用NA，如恩替卡韋、替諾福韋等。當入組患者出現肝功能異常時，合并使用保肝藥，如甘草酸二銨、水飛薊素等；當入組患者出現白細胞或血小板降低時，合并使用地榆升白片、益血生膠囊等藥物，嚴重時給予皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子注射液等對癥措施。

2.2 影響Peg-IFNα-2b治療CHB實現早期應答的臨床因素分析

根據患者的治療情況，將其分為早期應答組（early response group， ERG）和早期不應答組（early non-response group， NERG），并對兩組患者的性別、年齡、抗病毒治療史、基線時的HBsAg、HBV DNA、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TB）、直接膽紅素（DB）以及治療12周時的ALT、AST、TB、DB進行單因素分析。

結果顯示ERG （女51例，男69例）與NERG （女20例，男64例）患者的性別分布差異有統計學意義，ERG女性占比高于NERG（P=0.006）。同時發現，兩組患者的年齡、治療12周時的ALT、AST和DB的差異亦有統計學意義，ERG患者的年齡小于NERG（P=0.019），治療12周時的ALT （P=0.001）、AST （P=0.001） 和DB（P=0.043）高于NERG。其余指標的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 Peg-IFNα-2b治療CHB實現早期應答的單因素分析Table 1 Univariate analysis of predictors for early response of Peg-IFNα-2b in the treatment of chronic hepatitis B

以單因素分析P＜0.05且專業上有意義的因素，如性別（1=男，2=女）、年齡、治療12周時的ALT、AST和DB為自變量，早期應答（1=有，0=無）為因變量，進行多因素logistic回歸分析，方法選擇逐步回歸法，進入和排除標準分別為0.05和0.10。結果顯示性別、年齡以及治療12周時的AST是早期應答的獨立影響因素。女性、年齡越小及治療12周時AST越高，其早期應答發生的可能性越大（P＜0.05）。尚不能認為治療12周時的ALT和DB對早期應答的發生有影響（P＞0.10）。見表2。

2005年，紐約南區的聯邦檢察長發出傳票，指稱美國國會多數黨領袖比爾·傅利斯特 (Bill Frist)因涉嫌股票內線交易而遭調查。傅利斯特出身心臟外科醫生，潔身自好，在朝野上下一度口碑甚佳，從政后也面臨著如何出污泥而不染的考驗。盡管長達18個月的外查內調后來無疾而終，這一事件對國會參、眾兩院的議員們都是一記不容忽視的警鐘。

表2 接受Peg-IFNα-2b治療CHB實現早期應答的多因素logistic回歸分析Table 2 Multivariate logistic regression analysis of predictors for early response of Peg-IFNα-2b in the treatment of chronic hepatitis B

2.3 Peg-IFNα-2b治療早期外周血T淋巴細胞的分布及動態變化

對采集的樣本進行分組：健康對照（healthy control，HC，n=10） 組、CHB基 線 組（CHB/CHB 0周組，n=13）、實現早期應答的患者標本為ERG （不包括HBsAg清除時的血標本，因為HBsAg對于免疫功能存在抑制的作用[12]）以及未實現早期應答的患者標本為NERG；再根據已完成的療程分為：ERG 0周（n=8）和NERG 0周（n=5）、ERG 12周（n=16）和NERG 12周（n=12）、ERG 24周（n=8）和 NERG 24周（n=5）。通過流式細胞技術對PBMC中的CD4+T細胞、CD8+T細胞、Treg細胞等進行分析。見圖1。

圖1 外周血PBMC 流式分析圖Figure 1 Flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells

2.3.1 CD4+T細胞在治療早期外周血中的分布CD4+T細胞占總T細胞的百分比（CD4+T細胞百分比）在CHB組與HC組、ERG 0周與NERG 0周、ERG 12周與NERG 12周、ERG 0周與ERG 24周中差異均有統計學意義：CHB組高于HC組（P=0.025），ERG 0周高于NERG 0周（P=0.007），ERG 12周高于NERG 12周（P=0.006），ERG 0周同樣高于ERG 24周（P=0.012）。在整個治療早期（療程在24周內），CD4+T細胞百分比在ERG中明顯下降，在NERG中緩慢上升，在其他各組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 CD4+ T細胞在治療早期外周血中的分布Figure 2 The distribution of CD4+ T cells in peripheral blood at early stage of treatment

2.3.2 CD8+T細胞在治療早期外周血中的分布 CD8+T細胞占總T細胞的百分比（CD8+T細胞百分比）在CHB組與HC組、ERG 12周與NERG 12周、ERG 24周 與 NERG 24周、ERG 0周與ERG 24周中差異均有統計學意義：CHB組低 于 HC組（P=0.015），ERG 12周 低 于 NERG 12周（P=0.034），ERG 24周 高 于 NERG 24周（P=0.042），ERG 0周低于 ERG 24周（P=0.002）。在整個治療早期，CD8+T細胞百分比在ERG中明顯上升，在NERG中平緩或緩慢下降 。CD8+T細胞百分比在其他各組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 CD8+ T細胞在治療早期外周血中的分布Figure 3 The distribution of CD8+ T cells in peripheral blood at early stage of treatment

2.3.3 CD4+/CD8+T細胞比值在治療早期的變化 CD4/CD8比值在CHB組與HC組、ERG 0周與NERG 0周、ERG 12周與NERG 12周、ERG 0周與ERG 24周中差異均有統計學意義：CHB組高于HC組（P=0.016），ERG 0周高于NERG 0周（P=0.030），ERG 12周同樣高于NERG 12周（P=0.026），ERG 0周 明 顯 高 于 ERG 24周（P=0.006）。在整個治療早期，CD4/CD8比值在ERG中呈明顯下降，在NERG中緩慢上升。但是CD4/CD8比值在其他各組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 CD4/CD8比值在治療早期的變化Figure 4 The change of CD4+/CD8+ ratio at early stage of treatment

2.3.4 Treg細胞在治療早期外周血中的分布 Treg細胞占CD4+T細胞的百分比（Treg細胞百分比）在HC組與CHB組、ERG 24周與NERG 24周、NERG 0周與NERG 24周中差異均有統計學意義：CHB組高于HC組（P=0.025）、ERG 24周高于NERG 24周（P=0.002）、NERG 0周高于 NERG 24周（P=0.033）。在整個治療早期，Treg細胞百分比在ERG呈平緩或緩慢上升趨勢，在NERG則先平穩后明顯下降，尤其是在治療12～24周時。Treg細胞百分比在其他各組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 Treg細胞在治療早期外周血中的分布Figure 5 Distribution of Treg cells in peripheral blood at early stage of treatment

3 討論

要實現早期應答，Peg-IFNα-2b的免疫調節功能也發揮著重要的作用。Fletcher等[16]通過在具有完全免疫能力的CHB動物模型中研究重組IFNα確定了其免疫調節作用，而非直接的抗病毒活性，與治療反應最密切相關，表明NK/T細胞的細胞溶解和非細胞溶解機制介導了對重組IFNα治療的抗病毒應答。可見，T淋巴細胞在Peg-IFNα-2b抗HBV治療中的重要性。

然而，持續刺激引起的T細胞功能障礙或T細胞衰竭是多種慢性感染（如CHB）和癌癥中的一種免疫狀態[17]。CD8+T細胞在適應性免疫應答中起著核心作用，其特征在于大量擴增并分化為細胞毒性效應細胞，以清除異常細胞或外來因子。耗盡的CD8+T細胞與其功能的逐漸受損有關，尤其是在細胞增殖、細胞因子產生和抗原消除中。本研究中CHB組CD4+T細胞百分比、CD4/CD8比值高于HC組，CD8+T細胞百分比低于HC組的結果反映出CHB患者CD8+T細胞的嚴重耗竭。

在Peg-IFN治療的早期（24周），CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4/CD8比值以及Treg細胞的動態變化與早期應答的實現密切相關。其中，CD8+T細胞占主導地位，在實現早期應答的過程中其耗竭程度有所減輕，且與HBsAg的快速下降有關。CD8+T細胞在治療早期的上升趨勢以及因其上升而引起的CD4/CD8比值的下降預示著HBsAg快速下降的可能性，進而預示著實現功能性治愈的可能性。Thimme等[18]也通過大猩猩模型證明了CD8+T細胞在控制HBV感染中的重要性。而治療前較高的CD4+T細胞百分比也是預測HBsAg快速下降的影響因素之一，雖然在隨后的治療中出現下降趨勢，這可能是由于CD8+T細胞升高而導致的相對下降。至于Treg細胞百分比在ERG 24周中高于NERG 24周以及在NERG中出現下降趨勢（12～24周）可能的原因是負反饋調節。由于早期應答的免疫活動較不應答活躍，反射性地引起免疫抑制細胞Treg細胞百分比的升高。同時，這也提示治療24周時Treg細胞的百分比對于預測Peg-IFN的療效有一定作用。總之，分析Peg-IFNα-2b治療期間宿主免疫功能的狀態，不能以單個指標來做出判斷與決策，只有多指標結合，分析整個治療過程中的動態變化，才能更加準確地判斷患者的免疫狀態并預測療效。本研究的不足在于重點關注了免疫細胞，卻未涉及相應的細胞因子，對于免疫細胞功能的研究不夠徹底，有待進一步深入研究。

綜上所述，女性、年齡越小、治療12周時的AST越高，則在Peg-IFN治療CHB早期實現HBV DNA及HBsAg快速下降的可能性越大。外周血T淋巴細胞的分布以及治療早期的動態變化與CHB實現早期應答密切相關。其中，CD8+T細胞占主導地位。治療早期CD8+T細胞百分比的升高以及因其升高而導致的CD4/CD8比值的下降可用來預測Peg-IFNα-2b的療效。本研究也在免疫學角度為后期對于實現功能性治愈的研究提供了理論依據。