QSOX1、CXCL10、β2GPI在乙型肝炎病毒相關性肝病患者中的表達及相關性研究

李 曾， 謝 青， 李金強

乙型肝炎病毒（HBV）感染已嚴重威脅到人類的身體健康，因病毒持續感染刺激致使肝臟反復發作炎癥和纖維化，是慢性肝炎、肝硬化及原發性肝癌的首要病因[1]。尋找準確度較高、簡單無創的新型檢測指標對于HBV相關性肝病的病情評估判定具有重要的臨床意義。研究表明，巰基氧化酶1（quiescin sulfhydryl oxidase 1，QSOX1）作為巰基氧化酶家族中的一員，其過表達產生的大量過氧化氫可以通過改變細胞內部微環境，促進腫瘤的發生、發展[2]。趨化因子配體10 （chemokine ligand 10，CXCL10）及其受體之間的相互作用是腫瘤微環境的關鍵環節，在促進腫瘤細胞增殖等方面發揮重要作用，參與乙型肝炎（乙肝）相關肝癌的發生與發展[3]。β2糖蛋白Ⅰ（beta 2 glycoprotein I, β2GPI），β2GPI/抗 β2GPI抗體復合物能夠增強某些細胞株趨化因子表達[4]，β2GPI與HBsAg具有高度親和力，參與HBV的感染，促進HBV相關性肝癌的發生[5-6]。但目前臨床中缺乏系統的三者聯合檢測HBV相關性肝病的相關研究。本文旨在探索QSOX1、CXCL10、β2GPI在HBV感染不同階段的表達差異，為臨床尋找HBV相關性肝病早期診斷無創標志物提供線索。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例來源 通過單盲試驗選取2019年3月—2020年3月在長沙市第一醫院接受治療的HBV相關性肝病包括慢性乙肝、肝硬化、肝癌患者共120例，男68例，女52例，年齡18～63歲，平均（38.5±21.4）歲。

納入標準：HBV相關性肝病診斷及分期符合中華醫學會制定的《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》標準[7]；肝癌診斷依據我國《原發性肝癌診療規范（2019年版）》[8]；入院時未接受免疫調節和抗病毒治療；患者及其家屬均知情，簽署知情通知書。經過我院倫理委員會批準。

排除標準：同時合并或重疊感染其他嗜肝病毒，罹患自身免疫性肝病，合并有嚴重心肺腎等重要器官功能不全，糖尿病患者及其他免疫缺陷性疾病，妊娠期、哺乳期患者，精神病患者。

1.1.2 病例分布 患者分為慢性乙肝40例，男26例，女14例，平均年齡（38.5±21.4）歲，其中輕度15例，中度13例，重度12例；肝硬化40例，男20例，女20例，平均年齡（37.5±20.4）歲，其中代償期肝硬化18例，失代償期肝硬化22例；肝癌40例，男22例，女18例，平均年齡（38.0±20.9）歲。選取同時期非HBV感染肝病患者40例為非HBV肝病組，男20例，女20例，年齡20～65歲，平均年齡（40.4±19.4）歲，其中包括非酒精性脂肪肝肝炎20例，酒精性脂肪肝肝炎11例，藥物性肝炎9例。同期無HBV感染的健康體檢志愿者40例，為正常組，男25例，女15例，年齡18～66歲，平均（39.9±22.8）歲。各組之間患者性別、平均年齡等一般資料均具可比性，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 肝功能測定 抽取受檢者清晨空腹靜脈血5 mL，置于真空采血管（不含抗凝劑）中，血液凝固后，使用高速離心機以3 600 r/min的速度離心5 min，分離血清，分裝在EP管中，于－20℃冰箱中保存，待檢。采用放射免疫法測定患者肝功能指標丙氨酸轉氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）水平，試劑盒由上海海軍醫學研究所提供，采用日立7600-020全自動生化儀檢測，操作嚴格按照說明書進行，并保證質控符合國家標準。HBV DNA定量檢測采用熒光定量PCR分析儀檢測，均由上海海科華生物工程股份有限公司完成。

1.2.2 QSOX1、CXCL10、β2GPI檢測 采用ELISA測定QSOX1、CXCL10和β2GPI，試劑盒由蘇州卡爾文生物科技有限公司提供。測定前準備：①將標本稀釋至1 mL/瓶，室溫下溶解10 min，濃度是2 000 ng/L，溶解的標本先稀釋到1 000 ng/L，標本稀釋液做空白孔；②稀釋溶液A：稀釋前根據事先計算好的進行實驗所需要的總量進行配制（100 μL/孔），稀釋液A 1∶100稀釋；③稀釋溶液B，稀釋前根據事先計算好的進行實驗所需要的總量進行配制（100 μL/孔），稀釋液B 1∶100稀釋；④稀釋濃縮洗滌液：濃縮洗滌液30 mL于37 ℃恒溫箱，水浴15 min，搖勻，加入醫用蒸餾水720 mL，1∶25倍稀釋，備用。ELISA測定：酶標板每孔分別加待檢標本100 μL，晃動混勻，覆膜，37 ℃培育2 h；棄液，甩干，勿洗滌。每孔加A工作液100 μL，覆膜，37 ℃培育1 h；棄液，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，甩干；每孔加B工作液100 μL，覆膜，37℃培育1 h；棄液，甩干，洗板5次，每次浸泡 1～2 min，400 μL/每孔，甩干；每孔加底物液90 μL，酶標板覆膜37 ℃避光顯色15～30 min，終止條件為前3～4孔有明顯的梯度藍色而后3～4孔梯度并不明顯；加終止液50 μL/孔，反應得到終止，此時藍色即刻轉為黃色。終止液的加入順序與底物液的加入順序應盡量保持一致；采用波長450 nm的酶標儀測量各孔的光密度（D值）并讀數。根據D值計算待檢標本中的QSOX1、CXCL10和β2GPI的水平。

1.2.3 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件進行分析處理。計量資料采用x±s描述，多組間比較采用F值分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用百分率描述，組間比較采用χ2檢驗。相關性采用Pearson相關性分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 QSOX1、CXCL10、β2GPI水平及肝功能檢測結果

2.1.1 各組檢測結果比較 如表1所示，與正常組比較非HBV肝病組QSOX1、CXCL10、β2GPI水平，差異無統計學意義（P＞0.05），ALT水平高于正常組（P＜0.05）。肝癌組、肝硬化組、慢性乙肝組 QSOX1、CXCL10、β2GPI、ALT水平高于非HBV肝病組和正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）。肝癌組QSOX1、CXCL10、β2GPI表達高于肝硬化組和慢性乙肝組，ALT水平低于這兩組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。肝硬化組QSOX1、CXCL10、β2GPI表達高于慢性乙肝組，ALT水平低于該組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組研究對象QSOX1、CXCL10、β2GPI水平及肝功能比較Table 1 Results of QSOX1, CXCL10, β2GPI, and liver function tests in each group

2.1.2 不同嚴重程度慢性乙肝患者的檢測結果 如表2所示，中度慢性乙肝患者QSOX1、CXCL10、β2GPI、TBIL水平高于輕度患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。重度慢性乙肝患者QSOX1、CXCL10、β2GPI、TBIL表達高于中度患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 不同嚴重程度慢性乙型肝炎患者QSOX1、CXCL10、β2GPI表達水平及肝功能比較Table 2 QSOX1, CXCL10, β2GPI expression and total bilirubin levels in terms of severity of chronic hepatitis B

2.1.3 不同分期肝硬化患者檢測結果 如表3所示，非HBV肝病組與正常組QSOX1、CXCL10、β2GPI水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。失代償期肝硬化患者QSOX1、CXCL10、β2GPI、ALT、TBIL水平高于代償期肝硬化患者、正常組、非HBV肝病組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。代償期肝硬化患者 QSOX1、CXCL10、β2GPI、ALT、TBIL水平高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 不同分期HBV相關性肝硬化患者QSOX1、CXCL10、β2GPI水平及肝功能比較Table 3 QSOX1, CXCL10, β2GPI expression and liver function levels compared between patients in terms of HBV-associated cirrhosis

2.2 QSOX1、CXCL10、β2GPI與肝功能指標相關性比較

經過Pearson相關性分析發現，QSOX1與ALT呈正相關（r=0.374，P=0.018）；CXCL10與ALT 呈正相關（r=0.357，P=0.020）；β2GPI與 ALT呈正相關（r=0.389，P=0.010）。QSOX1與 TBIL呈正相關（r=0.642，P=0.001）；CXCL10與 TBIL呈正相關（r=0.472，P=0.009）；β2GPI與 TBIL呈正相關（r=0.644，P=0.001）。

3 討論

HBV是一個小DNA病毒，是嗜肝DNA病毒科的一種。HBV的感染已經嚴重威脅到全球人類的健康，它有流行性廣等特點，僅亞洲患病率已經超過了10%[9]。從臨床上來講，慢性乙肝發展成為原發性肝癌的概率特別大，而原發性肝癌每年能夠造成全球100萬人死亡[10]，并呈增長趨勢，因而需注重HBV相關性肝病尤其是肝癌的早期診斷治療。

QSOX1作為一種二硫鍵形成酶，對細胞內蛋白能起到氧化折疊作用，還可氧化生成過氧化氫[11]。QSOX1在腫瘤細胞中的分泌量較高，研究證實QSOX1水平與腫瘤的形成和發展有密切關系[12]。本研究結果顯示，在HBV相關性肝癌患者中，QSOX1呈現出顯著高表達，提示QSOX1表達的增加可能預示肝癌的發生和發展變化。同樣在HBV相關性慢性乙肝重度患者以及失代償期肝硬化患者中，QSOX1呈現出較高表達，表明QSOX1表達水平隨著肝病嚴重程度加重而增高。

CXCL10在趨化單核細胞和造血細胞集落形成中大量存在，抑制T細胞活化、介導細胞融解、抑制血管生成等[13]。CXC趨化因子對血管生成、肝臟炎癥發生、新生物增生、纖維化形成、免疫反應有重要影響，在肝硬化發生中也起到一定作用[14]。Toshiro等[15]證實，在慢性肝炎患者中CXCL10的含量比正常人顯著增高。以往研究證實，在HBV相關性肝病肝炎、肝硬化患者的肝臟中，CXCL10表達均有明顯增高，以及參與發生多種疾病[16]。CXCL10一方面參與血管的新生、腫瘤成長和器官硬化等，另一方面趨化白細胞炎癥聚集，可能參與乙肝相關肝癌的發展[17]。本研究結果顯示，在HBV相關性肝病、肝癌患者、慢性乙肝重度患者、失代償期肝硬化患者中，CXCL10的表達顯著增高，這說明炎癥反應隨著HBV相關性肝炎患者疾病的嚴重程度增加而加重，同時CXCL10的表達也隨之升高。

β2GPI被發現是自身免疫性疾病抗磷脂抗體綜合征重要自身抗原，近年來的研究表明β2GPI與機體的免疫功能有關[18-19]。據報道，β2GPI能與HBV表面抗原相結合，并且其結合的活性在病毒復制活躍的患者血漿中更強[20]。Abdel-Wahab等[21]研究表明，β2GPI還在與HBV相關性肝癌的發生機制中起到重要作用。本研究結果顯示，在HBV相關性肝病、肝癌患者、慢性乙肝重度患者和失代償期肝硬化患者中，β2GPI都呈現顯著高表達，提示β2GPI在HBV相關性肝病的發生中隨著疾病程度增加而呈現出高表達。

經過Pearson相關性分析，QSOX1、CXCL10、β2GPI與肝功能ALT、TBIL指標之間呈正相關，患者肝功能損傷越嚴重，HBV相關性肝病患者病情越重。

綜上所述，QSOX1、CXCL10、β2GPI可作為反映HBV相關性肝病患者肝臟炎癥損傷程度的重要指標，與患者肝功能損傷有一定的關聯，可能參與HBV相關性肝病發展，在HBV相關性肝病臨床診斷中具有重要價值。