腸桿菌科細菌對氨基糖苷類的耐藥性及16S rRNA甲基化酶基因的檢測研究

王 文， 王 亮， 陶 佳， 李 剛， 賈 偉

當前革蘭陰性桿菌的耐藥性日趨嚴重，尤其是多重耐藥和泛耐藥菌株的出現已成為全球關注的焦點。氨基糖苷類抗菌藥物因其抗菌譜廣、抗菌活性強，被用于抗耐藥革蘭陰性菌感染的臨床治療，尤其是腸桿菌科細菌所致的感染，已經成為聯合用藥的重要選擇之一[1]。但16S rRNA甲基化酶的出現和擴散，導致了細菌對氨基糖苷類抗菌藥物高水平耐藥，影響了其臨床抗感染治療。本研究對寧夏醫科大學總醫院2017年分離的氨基糖苷類耐藥腸桿菌科細菌的16S rRNA甲基化酶基因進行篩查，并對耐藥情況進行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集我院2017年1月1日—12月31日臨床診斷為各種包括呼吸道、腹腔、尿路、血流和皮膚軟組織等感染分離的非重復腸桿菌科細菌142株，其中包含對阿米卡星耐藥的腸桿菌科細菌72株（大腸埃希菌37株、肺炎克雷伯菌35株），對阿米卡星敏感的腸桿菌科細菌70株（大腸埃希菌32株、肺炎克雷伯菌38株），稱為氨基糖苷類耐藥/敏感腸桿菌科細菌。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853，購自上海漢尼生物技術有限公司。

1.2 儀器和試劑

采用法國生物梅里埃全自動細菌分析儀VITEK 2-Compact對細菌進行鑒定，儀器配套藥敏卡GN04初篩阿米卡星耐藥（MIC≥64 mg/L），肉湯微量稀釋法進行藥敏復核，按照2017年美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）標準判斷結果。

1.3 基因擴增和測序

將142株細菌分純培養后，用煮沸法提取細菌DNA[2]。取1 μL提取物做模板，對16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH、npmA） 進 行 PCR擴增，將陽性擴增產物送上海生工生物工程有限公司進行測序，所得序列用BLAST軟件（https:www.ncbi.nlm.nih.gov/）分別進行比對。引物見表1， 具體反應條件參見文獻[2-7]。PCR 產物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后經溴化乙啶染液染色15 min，在紫外凝膠成像儀中觀察并記錄結果。

表1 16S rRNA甲基化酶基因引物序列Table 1 Primers of 16S rRNA methylase genes used in this study

1.4 統計

采用WHONET 5.6軟件對細菌的標本來源、科室分布、藥敏進行統計分析。

2 結果

2.1 病例和標本的分布

142株腸桿菌科細菌主要收集于臨床明確診斷為呼吸道感染（31.7 %）、腹腔感染（23.9%）、尿路感染（23.3%）、血流感染（7.7%）等病例分離的菌株；大部分分離自痰液（31.0 %）、尿液（23.3%）、分泌物（11.3%）、血液（7.7%）等標本，見表2。142例患者中男79例，女63例；體溫為36.0～40.0℃；WBC（2.22～54.86）×109/L；診斷為呼吸道感染的45例患者的X攝片顯示肺部有炎性浸潤性改變、肺部積液等。68 例大腸埃希菌感染患者多見于尿路和腹腔感染，74例肺炎克雷伯菌感染者多見于呼吸道感染，分布較大腸埃希菌集中。氨基糖苷類耐藥株和敏感株所致感染分別占50.7%（72/142）和 49.3% （70/142），見表2。

表2 （續）Table 2（continued）

表2 142株腸桿菌科細菌感染患者相關的臨床信息Table 2 Clinical data of the patients associated with 142 strains of Enterobacteriaceae

2.2 細菌的耐藥性

72株氨基糖苷類耐藥腸桿菌科細菌對阿米卡星和慶大霉素均耐藥，對頭孢菌素類、氟喹諾酮類的耐藥率均大于80%，對酶抑制復合制劑頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦的耐藥率在50%以上，對替加環素、頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥率小于10%；其中37株大腸埃希菌對亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為29.7%、32.4%、37.8%；35株肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率均為40.0%。70株氨基糖苷類敏感的腸桿菌科細菌對阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、替加環素、頭孢他啶-阿維巴坦、哌拉西林-他唑巴坦均敏感。見表3。

表3 142株腸桿菌科細菌對抗菌藥物的耐藥性和敏感性Table 3 Antimicrobial susceptibility of 142 strains of Enterobacteriaceae to antimicrobial agents

2.3 16S rRNA甲基化酶基因檢測

經PCR檢測和DNA測序，共檢出71株16S rRNA甲基化酶基因陽性菌株，占總菌數的50.0%（71/142），在氨基糖苷類耐藥株中的陽性率 為 98.6%（71/72）。rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH、npmA均未檢測到，基因分布見表2，擴增產物電泳圖見圖1。

圖1 16S rRNA甲基化酶基因擴增產物電泳圖Figure 1 Electrophoresis map for PCR products of 16S rRNA methylase genes

3 討論

氨基糖苷類抗生素因其抗菌譜廣、高效且濃度依賴性的快速殺菌特點，成為臨床治療革蘭陰性桿菌感染有效的藥物之一。但隨著其廣泛應用，耐藥現象也隨之而來。細菌對氨基糖苷類藥物耐藥的主要機制是產生氨基糖苷類修飾酶AME以及16S rRNA甲基化酶[8]，自2003年法國報道了產 16S rRNA甲基化酶的肺炎克雷伯菌后，多個國家均在革蘭陰性桿菌中發現16S rRNA 甲基化酶[9-10]。

本組資料顯示，對氨基糖苷類抗生素耐藥的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對頭孢菌素、氟喹諾酮類、氨曲南的耐藥率均≥77.1%；對頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦等β內酰酶抑制劑復合制劑的耐藥率≥51.4 %；還顯示氨基糖苷類耐藥的肺炎克雷伯菌對3種受試的碳青霉烯類藥物的耐藥率均為40.0%，但氨基糖苷類耐藥的大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率為29.7%～37.8%，與吳瓊等[11]報道的均敏感不一致。由此可見氨基糖苷類耐藥的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌如同臨床上發現的ESBL等菌株一樣，亦是一類多重耐藥菌株，或為廣泛耐藥菌株，需引起重視。所幸，替加環素及頭孢他啶-阿維巴坦對這兩種氨基糖苷類耐藥的腸桿科細菌都有較好的抗菌活性，細菌的敏感率均≥94.3%。相比較氨基糖苷類耐藥株，氨基糖苷類敏感肺炎克雷伯菌對多數受試抗菌藥物均較為敏感，細菌耐藥率均≤15.4%；但氨基糖苷類敏感大腸埃希菌對第三、第四代頭孢菌素和氨曲南的耐藥率≥25.8%，對氟喹諾酮類抗菌藥物環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率為58.1%。因此在抗感染治療時須依據藥敏試驗結果報告慎重選用抗菌藥物。

本研究中， 儀器法檢測到4株對阿米卡星耐藥的大腸埃希菌，而慶大霉素對這4株菌株的MIC分別為8、8、≤1、≤1 mg/L，為一類慶大霉素中介/敏感菌株；經阿米卡星和慶大霉素肉湯稀釋法復核后，結果顯示此4株細菌均對阿米卡星和慶大霉素耐藥，且都攜帶rmtB基因，證實儀器法檢測結果為慶大霉素假敏感。先前Ko等[12]于2017年也有過類似報道，稱VITEK-2 自動化系統對氨基糖苷類高水平耐藥可能被錯誤地檢測為敏感。此類不一致的藥敏試驗現象值得引起臨床微生物實驗室常規藥敏檢測的重視。

據文獻報道，16S rRNA甲基化酶基因的分布因地域不同而有所差異。在歐洲以armA為主，在北美洲以armA和rmtB為主，拉丁美洲以rmtD為主[13]；在國內，如廣州、長沙等南方地區以armA為主[14-15]；上海、江浙地區以rmtB為主[11,16]。本組資料顯示，16S rRNA甲基化酶基因以rmtB為主，占76.1%（54/71），armA次之，為19.7%（14/71），與上海、江浙地區報道相似，基因分布的差異可能與菌株的來源及用藥習慣的差異有關。本組資料中，發現1株rmtB和armA同時擴增陽性菌株以及2株rmtA陽性菌株，國內未見rmtA基因存在于腸桿菌科細菌中的報道。1株耐藥大腸埃希菌所有基因擴增均陰性，推測可能存在其他未檢測到的耐藥機制。在70株氨基糖苷類敏感的腸桿菌科細菌中均未檢測到16S rRNA甲基化酶基因，此與2010年余方友等[16]國內報道的研究結果一致。Joel等[17]2015年曾報道發現16S rRNA甲基化酶基因和碳青霉烯酶基因可存在于同一菌株中。本組資料亦顯示有近40%的氨基糖苷類耐藥的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌對碳青霉烯類耐藥，但本研究未對該類耐藥細菌的碳青霉烯酶基因進行檢測，有待進一步研究。

本組資料雖然沒有過多的除阿米卡星和慶大霉素之外的其他氨基糖苷類抗菌藥物的研究和相關傳播機制等研究，但文獻報道，16S rRNA甲基化酶與氨基糖苷類高濃度耐藥存在相關性，且16S rRNA甲基化酶基因位于轉座子、質粒等可移動基因元件中，能突破地域和種屬界限，廣泛進行水平傳播和克隆傳播[18]，因此應對16S rRNA甲基化酶基因進行早期篩查和監控，并采取措施防止耐藥菌株傳播。有待擴大樣本量，繼續調查本地區16S rRNA甲基化酶基因的流行情況，研究其耐藥基因的傳遞機制，為控制醫院感染和臨床抗感染治療提供科學依據。