ω-3多不飽和脂肪酸調控Wnt/β-catenin通路預防神經管畸形的機制研究

游雪云，劉艷秋，吳敏

（1.江西省婦幼保健院產前診斷中心，江西 南昌 330006；2.臨川區第一人民醫院檢驗科，江西 撫州 344100）

神經管畸形(NTD)是胚胎神經管無法完成正常閉合而導致的一種先天畸形,其中多不飽和脂肪酸（PUFA）代謝調節紊亂是導致NTD 發生的最重要原因，長鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA）是神經系統的重要結構組分，尤其是ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3-PUFA），但其功能目前尚不清楚。我們的前期研究發現：ω-3-PUFA 代謝產生的類花生酸TXA2、PGl2 能夠參與調控營養物質由母親經胎盤到胎兒的轉運,同時促進Hcy 代謝中一些關鍵基因；Hcy升高可以激活Wnt/β-catenin 信號通路，可能在神經管發育過程中發揮作用。鑒于此,筆者團隊于2019年1 月至2020年9 月在江西省婦幼保健院中心實驗室以ω-3-PUFA 為切入點,通過不同飼料喂養的孕鼠腹腔注射VPA 建立起VPA 鼠模型，探討ω-3-PUFA在Hcy 協同下調控Wnt/β-catenin信號通路預防神經管畸形中的功能和作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級6 周齡ICR 小鼠(雌鼠50 只，雄鼠25 只)由南昌樂悠生物科技有限公司提供，孕期所需的橄欖油強化飼料由江蘇美迪森生物醫藥有限公司加工。VPA:≥98%，Sigma-Aldrich Co.LLC.總蛋白測定試劑盒:A045-2，由南京建成生物工程研究所提供。Hcy 代謝通路中關鍵基因（CASC2c、MTHFR、CSE和CSCA2）mRNA表達檢測所需試劑為UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 qRT-PCR 檢測目的基因mRNA的表達通過Primer bank 搜索目的基因的引物，使用NCBI數據庫進行blast 比對后，由上海生物有限公司合成。取新鮮的胎盤組織約50mg，Trizol 法提取總RNA 并反轉錄為cDNA，以表1 操作方法進行反轉錄,以表2 引物序列和表3 定量PCR 反應體系進行擴增。950C 預變性5min,循環擴增階段950C 變性15s,580C 退火30s,720C 延伸69s，32 個循環，720C 保溫10min。

表1 反轉錄反應體系

表2 qPCR 引物序列

表3 SYBR Premix Ex Taq 配制熒光定量熒光定量PCR 反應體系

1.2.2 Western blot 法檢測目的蛋白的表達 取新鮮胎盤組織約50mg,用冷PBS 洗滌三次,加入500μl 裂解液，勻漿后12000rmp 離心10 min，收集上清液(總蛋白溶液)用BCA 法測定蛋白濃度，于－80℃冰箱保存。10% 分離膠SDS-PAGE 電泳，120V轉膜75min，麗春紅染色，室溫下封閉1h，將轉印膜用預先稀釋好的—抗于40C 孵育過夜。然后用TBST 于室溫下脫色，搖床上洗三次，每次5min。用二抗(用TBST 稀釋3000 倍)孵育轉印膜30min(室溫)，然后在脫色搖床上用TBST 洗三次(室溫)，每次5min。ECL 化學發光1min，曝光顯示目的條帶，掃描儀掃描，保存數據。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0 軟件進行數據分析，并用GraphPad Prism 5 軟件作圖。定量數據以表示，各組均數間比較，方差齊時采用t 檢驗，方差不齊時采用近似t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測CASC2c及β-catenin mRNA的表達水平 ω-3 PUFA 組CASC2c mRNA 相對表達量為對照組的1.166，P=0.0196，差異有統計學意義(P＜0.05)；ω-3 PUFA 組β-catenin mRNA的相對表達量為對照組的1.272，P=0.0110，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

2.2 Western blot 法檢測CASC2c和β-catenin蛋白表達水平 Western blot 分析可得，ω-3PUFAs 組CASC2c、β-catenin mRNA 相對表達量均較Control組顯著增多，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。CASC2c蛋白高表達組明顯抑制β-catenin (*P<0.05)的表達，見圖2。

圖1 CASC2c和β-catenin mRNA 相對表達量的比較

圖2 CASC2c對Wnt/β-catenin 信號通路的影響

3 討論

神經管畸形(NTD)為胚胎發育過程中出現的疾病，是一類嚴重的先天畸形，其發病率在新生兒中約占1/1000[1]。研究表明，NTD的發生與遺傳、環境均有關系。其中，多不飽和脂肪酸代謝調節紊亂是導致NTD 發生的最重要原因，尤其是ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3-PUFA），但其功能目前尚不清楚[2]。Huang 等動物實驗表明，ω-3-PUFA的攝入促進了大鼠肝臟中Hcy 代謝通路關鍵酶的mRNA表達如CASC2c、MTHFR、MATla、CBS、GNMT、MTRR 等，并降低了血漿中Hcy的水平[3]。

本實驗以ICR 小鼠為模型系統地研究了VPA及膳食脂肪酸的攝入對葉酸一Hcy 代謝通路中關鍵基因的表達的影響。以往的研究表明，VPA對葉酸一Hcy 代謝具有抑制作用：Ubeda 等人的動物實驗表明VPA 能夠升高血清中Hcy的水平，并能抑制MAT 酶(催化Met 轉化為SAM)的活性。本實驗發現VPA 注射完成6h 或(和)24h 以后抑制了孕鼠肝臟中葉酸一Hcy的代謝中關鍵基因CASC2cm-RNA表達和蛋白表達，這表明VPA的注射還可通過抑制葉酸-Hcy 代謝通路中以上基因的表達來阻礙Hcy的正常代謝。這些結果表明孕鼠腹腔注射VPA通過抑制孕鼠肝臟中葉酸Hcy 代謝通路中關鍵基因的表達升高了胚胎中Hcy的水平進而導致了胚胎NTD的發生。以往動物實驗也表明PUFA的攝入能夠顯著降低血液中Hcy的水平[4]。在本實驗中我們發現孕鼠橄欖油的攝入也能夠有效地阻止VPA對胚胎中Hcy的升高作用，ω-3-PUFA的攝入能夠升高葉酸-Hcy 代謝通路中關鍵基因(如CASC2c、CBS、MTRR 等)的mRNA和蛋白表達。以上研究結果表明ω-3-PUFA的攝入可能通過緩解VPA對孕鼠肝臟葉酸一Hcy 代謝通路中CASC2c、DHFR、MTRR、GAMT、CBS及CSE表達的抑制作用使胚胎中的Hcy水平維持正常水平進而降低了胚胎中VPA 誘導的NTD的發病率。

近年的研究表明Hcy與胚胎的先天畸形密切相關。Felkner 等人在德克薩斯州一墨西哥邊境國家開展了一項病例對照實驗發現血清中Hcy水平也與NTD的發病風險呈正相關[5]。中國以及非洲國家的研究也觀察到了相似的結果[6,7]。然而關于Hcy是否能直接導致神經管畸形的發生尚存在爭議。Greene 等人的動物實驗表明用Hcy 硫代內酯培養小鼠胚胎并不能夠升高其NTD的發病率，這表明Hcy 可能不是直接誘導NTD的發生，生育NTD 胎兒的母親具有較高的Hcy水平可能只是Hcy 代謝紊亂的一種反映[8]。

誘發氧化應激及細胞凋亡是高同型半胱氨酸血癥主要的致病機制之一,但其中的具體機制還不是非常清楚,有報道認為高同型半胱氨酸血癥可以激活Wnt/β-catenin 信號通路[9]。Wnt/β-catenin 信號轉導通路是一條在生物進化中極為保守的通路。在正常的體細胞中,β-catenin 只是作為一種細胞骨架蛋白在胞膜處與E-cadherin 形成復合體對維持同型細胞的黏附、防止細胞的移動發揮作用。只有當細胞外Wnt 信號分子與細胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結合激活胞內的dishevelled (散亂的)蛋白導致GSK3B 失活,使α-catenin 避免被磷酸化而遭降解的命運,β-catenin 才能在胞質中積累起來。當胞質中β-catenin的濃度達到一定水平時,就可向細胞核轉移。在胞核中β-catenin與轉錄因子家族Tcf/Lefs 結合,可激活cyclinD1和cmyc 等原癌基因而導致細胞的增殖、分化、成熟。顯然，在這條信號通路中β-catenin 發揮了重要作用,其在胞質中積累繼而向胞核的轉位,被認為是該信號通路被激活的標志。Wnt/β-catenin 信號通路在調節細胞增殖，細胞凋亡等活動中發揮重要作用，該信號通路的失衡會導致許多疾病，如神經管畸形，心臟發育畸形，神經退行性疾病等。神經管畸形是與高同型半胱氨酸血癥相關的一類出生缺陷，已有文獻報道高同型半胱氨酸血癥導致神經管畸形的機制也誘發了氧化應激，從而激活了在發育中起到重要作用的Wnt/β-catenin 信號通路。近年研究發現，Wnt/β-catenin 信號通路是哺乳動物中樞神經系統（CNS）發育的關鍵信號通路之一。當Wnt/β-catenin 信號通路處于持續激活狀態，腦組織中NSCs 一直處于有絲分裂周期之內，NSCs的數目也持續增加。Zhang 等對體外培養的小鼠NSCs（NE-4C）進行體外沖擊波治療（rESWT），后者激活了Wnt/β-catenin 信號通路，隨后檢測發現，經過電刺激的小鼠NSCs 不斷增殖，并且一直處于未分化狀態[10]。Qi 等從SD 大鼠中分離NSCs，并且在含有0.3%氧氣的微氧培養系統中盡心培養，結果顯示，在缺氧條件下，NSCs 內β-catenin水平升高與NSCs 持續增殖呈正相關[11]。以上研究均證實,Wnt/β-catenin 信號通路可促進NSCs 增殖,在NSCs 發育過程中扮演重要角色。最近又有研究報道提示該通路信號轉導是作為神經元細胞形成的開關，因此對于神經元細胞的維持和增殖是重要的，特別是在神經管畸形（NTD），預防出生缺陷的研究中具有重要意義[12,13]。

ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3-PUFA）屬于長鏈脂肪酸的主要類別之一，是PPARs的潛在激活劑，Chang 等研究表明，肌肉中ω-3多不飽和脂肪酸富集增加了肌肉中的IMF 含量，影響脂肪生成相關基因的表達，還有證據表明ω-3多不飽和脂肪酸抑制細胞培養中的Wnt/β-catenin 信號通路，誘導PPARs表達和Wnt 信號傳導[14,15]。本實驗的研究結果表明，VPA 能夠抑制孕鼠肝臟中PUFA的合成，并能造成肝臟及胚胎中葉酸一 Hcy 代謝通路中關鍵基因表達的紊亂，進而影響葉酸-Hcy的正常代謝。而ω-3-PUFA的攝入能有效緩解VPA 所引起的孕鼠肝臟及胚胎中葉酸-Hcy 代謝通路一系列基因mRNA和蛋白的表達紊亂，這表明PUFA的缺乏及葉酸一Hcy 代謝紊亂是導致NTD 發生的重要因素，而PUFA的攝入能夠通過彌補機體PUFA的不足及調控葉酸-Hcy的正常代謝預防NTD的發生。