河源地區新生兒聽力與基因聯合篩查模式應用分析

劉運華，吳坤，劉曉燕，李婷婷，王葭，李登峰

（1.廣東省河源市婦幼保健院醫學遺傳實驗室；2.廣東省河源市婦幼保健院兒童保健科，廣東 河源 517000）

先天性聽力損失作為全球最常見的感覺功能障礙性疾病，除表現患兒聽力功能下降外，還可對患兒智力、語言的發育造成不良后果[1]。幼兒期的聽力下降會導致言語障礙、學習表現差和增加輟學的風險，影響未來就業等問題[2]。研究發現2015年全球聽力損失率大大高于2013年之前公布的估計值[3]。因此提高聽力損失防范意識、重視耳聾的出生缺陷防控工作顯得尤為重要。

傳統技術，耳聲發射法（otoacoustic emission，OAE）不能用于檢測聽神經性功能障礙，其結果存在一定假陰性，而自動判別聽性腦干誘發電位法（auto auditory brainstem response，AABR）費時長，成本高，最關鍵是其不能發現遲發型、漸進性及藥物敏感性的聽力損失。研究發現先天性聽力損失的兒童，80%是由遺傳原因導致。遺傳性耳聾根據有無外耳及其它器官畸形等臨床癥狀分為綜合征型耳聾（約30%）和非綜合征型耳聾（約70%）。非綜合征型遺傳性聽力損失具有遺傳異質性的特點，東亞人群遺傳性耳聾基因以GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA及GJB3 突變為主。迄今為止，已在110多個基因中鑒定出6000多個致病變異，其中確定了超過40 個致病基因[4]。由此可見，新生兒聽力篩查聯合遺傳性耳聾易感基因篩查，將能大大減少聽力損失患兒的發生。

河源地區是客家人主要聚集地之一，有種族和地域特色。河源戶籍新生兒遺傳性耳聾基因分布特點尚未知。本研究旨在通過分析6738例河源戶籍新生兒聽力篩查和4 個遺傳性耳聾基因13個致病變異攜帶情況，探討新生兒聽力檢查與遺傳性耳聾易感基因聯合篩查模式效果及其應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選2018年12 月-2020年12 月在我院出生并進行聽力篩查及耳聾基因檢測的新生兒6738例，出生時Apgar 評分均為10 分，所有新生兒均為母嬰同室,均無產科并發癥；其中男嬰3620例，女嬰3118例。男嬰母親孕齡29.08±4.75（歲）、女嬰母親孕齡28.75±4.59（歲），男嬰出生體重3166.11±441.69（g）、女嬰出生體重3077.88±444.77（g），男嬰身長49.99±7.65（cm）、女嬰身長49.61±1.64（cm），男嬰分娩孕周38.89±1.65 (周)，女嬰分娩孕周39.10±1.49 (周)。父母均為河源籍貫，聯合篩查前均進行充分的知情同意。

1.2 材料 DNA 自動提取儀Lab-Aid 824及配套試劑（致善生物有限公司）、耳聾易感基因檢測試劑（潮州凱普生物化學有限公司）、VertiTMDx 96 Well Thermal Cycler RCR 擴增儀(賽默飛)、丹麥AccuScreen 新生兒聽力篩查器（上海涵榮醫療器械有限公司）。

1.3 聽力篩查方法 2010年衛生部頒發《聽力篩查技術規范（衛婦社發〔2010〕96 號）》，要求新生兒出生后48h 至出院前完成初篩第一階段（OAE/AABR），未通過者及遺漏者于42d 內進行初篩第二階段（OAE+AABR）。

1.4 耳聾基因篩查方法 采新生兒EDTA 抗凝臍帶血2ml，提取基因組DNA，本研究采用PCR 導流雜交技術檢測4 個耳聾基因13 個位點（見表1），雜交程序按照生產廠家說明進行。耳聾基因篩查陽性指13 個位點出現任一個位點突變，反之為陰性。

1.5 Sanger 測序法在Applied Biosystems 3500 Dx基因分析儀（Applied Biosystems by Life Technologies，Japan）中使用BigDye Terminator v3.1（Applied Biosystems by Life Technologies，USA）循環測序試劑盒。用生物信息學軟件Alamut Visual 2.11進行比對和注釋，檢測到的序列與NCBI 所提供線粒體基因參考序列（NC_01292）進行比對和注釋，突變的表述參照Human Genome Variation Society(HGVS) version 15.11 進行。

1.6 統計方法 用SPSS23.0 進行統計分析，計數資料以率表示，采用皮爾森卡方檢驗比較兩組間計數資料的差異，例數小于5 時采用確切概率法計算卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 聽力初篩結果 初篩第一階段總陽性率5.51%（371/6738）,男嬰6.24%(226/3620),女嬰4.65%(145/3118)，男嬰高于女嬰，差異有統計學意義（χ2=8.17，P＜0.05）。初篩第一階段未通過者在42d 內接受復篩，初篩第二階段總陽性率11.32%(42/371)，男嬰10.62%(24/226)，女嬰12.41%(18/145)，男嬰與女嬰無差異(χ2=0.28，P＞0.05),聽力篩查總陽性率0.62%(42/6738)，男嬰0.66% (24/3620)，女嬰0.58% (18/3118)，男嬰與女嬰d 無差異（χ2=0.19，P＞0.05）見表2。

2.2 耳聾基因篩查結果 突變總攜帶率3.01%(203/6738)，含復合雜合突變2例，均為GJB2 合并SLC26A4 雜合突變；4 個基因突變率從高到低依次是GJB2 為1.44%(97/6738)、SLC26A4 為1.34%(90/6738)、mtDNA 為0.19%(13/6738)和GJB3 為0.07%(5/6738)。突變位點頻率前6 位依次為c.235delC、IVS7-2A>G、m.1555A>G、c.1229C＞T、c.2168A>G及c.299delAT。突變位點攜帶率在不同性別的分布無顯著性差異（χ2=0.34，P＞0.05），其中GJB3基因突變攜帶率男女之間分布無顯著差異（χ2=2.41，P＞0.05），見表3、圖1。

圖1 6738例新生兒13 個耳聾基因位點篩查突變情況

2.3 Sanger 測序結果通過Sanger 測序法檢測19例PCR 導流雜交技術未能明確突變的嬰兒，送試劑廠家檢測。結果顯示:19例嬰兒均為線粒體12sRNA 或tRNA的均質型突變者，其中致病突變4例（m.7444G>A 2例、m.7443G>A 2例），良性突變10例（m.1503G>A 8例、m.12193A>G 2例），致病性未明突變5例（m.7433C>T 3例、m.7419G>A 1例、m.12196C>T 1例），見圖2。

圖2 線粒體基因中2 種致病性未明的突變。（A）代表正常基因的野生型mtDNA G.7445A＞G（上圖，起始位置使用紅框標注）和代表突變基因的均質型mtDNA m.7433C>T（下圖，突變位置使用紅框標注）。（B）代表正常基因的野生型mtDNA G.12201T＞C（上圖，起始位置使用紅框標注）和代表突變基因的均質型mtDNA m.12196C>T（下圖，突變位置使用紅框標注）。

2.4 廣東省內各市新生兒耳聾基因篩查情況 廣東省其它地市新生兒耳聾基因篩查數據[5-16]，結果顯示：河源市耳聾基因總攜帶率為3.04%（此處總攜帶率按各耳聾基因相加得出），廣東省3.70%、廣州市3.68%、深圳市4.38%、佛山市3.08%、東莞市3.39%、中山市3.64%、珠海市4.11%、江門市3.69%、茂名市3.07%、陽江市4.30%、韶關市3.93%、清遠市2.64%及梅州市4.88%，各市間耳聾基因總體攜帶率差異有統計學意義（χ2＝105.89，P<0.05）。河源市總體攜帶率低于廣東省平均水平,差異有統計學意義（χ2＝7.84，P<0.05）。各地市4 個耳聾基因攜帶率從高到低依次均為GJB2、SLC26A4、12SrRNA和GJB3,河源市4 個耳聾基因分布情況與其他市一樣。河源市GJB2、SLC26A4、12SrRNA和GJB3分布百分比分別為47.32%、43.90%、6.34%、2.44%,廣東省GJB2、SLC26A4、12SrRNA和GJB3 分布百分比分別為53.91%、34.78%、6.26%、5.05%，兩者GJB2、SLC26A4和GJB3 分布百分比差異有統計學意義（χ2＝59.94，P<0.05；χ2＝42.06，P<0.05；χ2＝56.15，P<0.05）。河源人群中SLC26A4 百分比高于廣東省人群水平，差異有統計學意義（χ2＝7.18，P<0.05），GJB2、GJB3 百分比低于廣東省人群水平，提示河源地區耳聾基因篩查中需提高防范SLC26A4基因突變意識，見圖3。

圖3 廣東省內各地市新生兒耳聾基因篩查情況。

2.5 聽力與耳聾易感基因聯合篩查結果聯合篩查陽性以聽力篩查、耳聾易感基因篩查結果任意一項陽性判定為陽性,作為聽力損失新生兒或高危新生兒。聯合篩查陽性率3.58%(241/6738)、聽力篩查陽性率0.62%（42/6738），差異有統計學意義（χ2=142.94，P＜0.05），見表4。

表4 聽力與耳聾易感基因聯合篩查新生兒聽力損失效能（例）

3 討論

新生兒聽力與基因聯合篩查模式理念是2007年由王秋菊[17]等首次提出。新生兒聽力篩查是通過多種客觀的篩查措施進行早期檢測新生兒聽力損失，一直以來是人們研究的方向。從主觀評價研究（行為觀察測聽、視覺強化測聽) 上升到OAE和AABR 等客觀測量,近年來發展到通過PCR 導流雜交法、微陣列芯片法、全基因組測序等從基因水平篩查。主觀評價高度依賴于檢測人員的技能且容易受兒童的成熟年齡影響。OAE和AABR 利用測量聽覺誘發電位客觀確定聽覺系統的功能狀態,不僅降低操作人員專業能力的要求，并可在任何年齡進行。Berg[18]比較OAE 后AABR的傳統方案與AABR 后OAE 兩種篩查方案，發現OAE 后AABR的傳統方案在時間方面更有效。發展中國家多在第一階段進行OAE，在第二階段進行AABR。相比之下,發達國家多采用兩個階段均進行OAE和AABR 篩查。我市采用兩階段篩查方案，第一階段進行OAE 初篩,第二階段進行OAE和AABR 篩查。我們研究顯示，初篩第一階段總陽性率5.51%，男嬰6.24%，女嬰4.65%，差異有統計學意義（χ2=8.17，P＜0.05）。考慮到新生兒出生時可能存在耳道堵塞、鼓室內有羊水、外耳道狹窄、新生兒喉鳴聲干擾等現象。初篩第一階段未通過者42 天內接受復篩,初篩第二階段總陽性率11.32%,排除了329名初篩第一階段假陽性新生兒。與以往的研究一致,將AABR 納入新生兒篩查項目可有效獲得更好的聽力篩查結果[19]。此外聽力初篩總陽性率為0.6 2%，低于國內其它研究[20]。

本研究共分析6738例新生兒，耳聾基因攜帶率3.01%(203/6738)，低于廣東省其它市報道的攜帶率[6-17]。本研究發現河源人群SLC26A4基因百分比為43.90%，高于廣東省人群百分比水平，差異有統計學意義（χ2＝7.18，P<0.05）。位于7 號染色體上的SLC26A4基因編碼一種轉運跨膜蛋白,對于轉運氯化物-碘化物和調節淋巴內的離子穩態至關重要，該基因突變可能破壞耳蝸的離子穩態，導致聽力喪失[21]。已有強有力的證據表明c.1229C＞T和c.2168A＞G 突變與前庭導水管擴張相關[22]。有報道指出在亞洲非綜合征型耳聾患者中,中國人SLC 26A4基因IVS7-2A>G 突變的風險增加[23]，研究提示河源地區耳聾基因篩查中需提高防范SLC26A4基因突變意識，生活中盡量避免感冒、頭部撞擊等情況發生。此外，線粒體DNA(mtDNA)引起的耳聾又稱為藥物性耳聾，mtDNA 上12SrRNA和tRNA的變異可引起以母系遺傳為主的遺傳性耳聾，其中12SrRNA 變異相對常見,河源人群中12SrRNA突變基因百分比為6.34%，檢出均質型藥物性耳聾基因攜帶者10 名，若遵循醫囑避免相關氨基糖苷類藥物使用，將避免藥物性耳聾的發生。研究發現19例非常見耳聾易感基因位點突變，均為mtDNA均質型突變攜帶者，其中致病突變4例（m.7444G>A 2例、m.7443G>A 2例），良性突變10例（m.1503G>A 8例、m.12193A>G 2例），致病性未明突變5例（m.7433C>T 3例、m.7419G>A 1例、m.12196C>T 1例）。劉玲[24]等人發現廣東省694例非綜合征型耳聾患者GJB2、SLC26A4基因共有75種變異，其中46 個致病性突變，29 個意義不明。由此可見廣東省非綜合征耳聾基因突變譜需進一步完善，本研究提供2 個潛在致病位點，為建立廣東省出生缺陷臨床防控模式提供寶貴資料。

本研究將聯合篩查結果任意一項陽性判定為陽性，作為聽力損失新生兒或高危新生兒。由研究表明[25]，聯合篩查有重要臨床實踐意義。本研究與其它地市結果一致,新生兒聽力和耳聾基因聯合篩查在河源地區開展有良好臨床效益與社會效益，一方面聽力損失的基因檢測可以幫助避免不必要和昂貴的臨床檢測，提供預后信息并對未來社會婚育提供科學的遺傳指導。另一方面，隨著基因治療技術進一步發展，有望在未來緩解或逆轉由遺傳原因導致的聽力損失。