應(yīng)用于花斑裸鯉增殖放流效果評價的兩種標(biāo)記方法對比研究

李柯懋，簡生龍，王國杰，賈銀濤，馮 秀，關(guān)弘弢，高桂香，陳靜影，張秀茜，李得康，李英欽，龍存敏

(1.青海省漁業(yè)技術(shù)推廣中心，青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測中心，西寧 810012；2.青海省高原水生生物及生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810012；3.中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢 430072)

黃河上游所處的青海三江源地區(qū)地處青藏高原腹地，是長江、黃河、瀾滄江三大河流的發(fā)源地，肩負(fù)著涵養(yǎng)水源和維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要功能，是我國生態(tài)建設(shè)的戰(zhàn)略要地。魚類是維系生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定平衡的重要組成部分，黃河上游土著魚類組成簡單，主要由裂腹魚亞科、亞科和條鰍亞科的魚類組成，其中，裂腹魚亞科以花斑裸鯉(GymnocypriseckloniHerzenstein)、黃河裸裂尻魚(SchizopygopsispylzoviKessler)、厚唇裸重唇魚(GymnodiptychuspachycheilusHerzenstein)等為主；亞科以刺(AcanthogobioguentheriHerzenstein)為主；條鰍亞科以高原鰍為主[1]。近年來，黃河上游涉水工程建設(shè)呈加速態(tài)勢[2]，據(jù)不完全統(tǒng)計，上游干流地區(qū)已建設(shè)大壩11座，規(guī)劃大壩14座，這些工程已嚴(yán)重破壞了黃河上游土著魚類資源。大壩建設(shè)不僅影響了河流自然景觀的完整性和連續(xù)性，還使魚類由連續(xù)性分布向點(diǎn)狀分布改變，魚類物種遷移和基因流動受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致魚類群體結(jié)構(gòu)趨向簡單化，種質(zhì)退化，物種多樣性逐步喪失[3]。此外，水利工程建設(shè)形成的各型水庫推動了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，加之以往不規(guī)范的放生活動，外來魚類有所增加，目前，青海省黃河水域已發(fā)現(xiàn)26種外來魚類[4]。

增殖放流是國內(nèi)外公認(rèn)的補(bǔ)償受各種因素影響的水生生物最有效的手段之一，也是目前緩解各國漁業(yè)資源衰退[5]、改善水域生態(tài)環(huán)境的一項有效措施。雖然增殖放流對改善漁業(yè)資源乃至生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義，但是其實(shí)際效果如何一直是管理部門所關(guān)心的核心問題。增殖效果評估是評價增殖放流工作有效性的重要環(huán)節(jié)，其中標(biāo)記放流技術(shù)的選擇是關(guān)鍵。標(biāo)記方法的優(yōu)劣也將直接影響標(biāo)記群體回捕率及后續(xù)資源補(bǔ)充評估的準(zhǔn)確性[6]。標(biāo)記放流技術(shù)在我國已取得了長足的發(fā)展[7]。目前，在眾多的標(biāo)記方法中，可見植入熒光標(biāo)記和金屬線碼標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛，且被證明在多種魚類中標(biāo)記效果良好[8-10]。

為了補(bǔ)償水利工程建設(shè)對黃河土著魚類資源的影響，黃河上游地區(qū)也開展了魚類增殖放流。目前黃河上游地區(qū)持續(xù)開展的規(guī)模化放流的魚類主要為花斑裸鯉。花斑裸鯉為鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚亞科(Schizothoracinae)裸鯉屬(Gymnocypris)。花斑裸鯉作為黃河上游主要保護(hù)魚類之一，2009-2020年已累計放流1 581萬尾數(shù)。雖然對花斑裸鯉開展了大規(guī)模增殖放流，但對放流效果沒有進(jìn)行較系統(tǒng)的評價研究。本研究利用可見植入熒光標(biāo)記和金屬線碼標(biāo)記對花斑裸鯉進(jìn)行標(biāo)記，從標(biāo)記對魚苗的影響、標(biāo)記保持率、回捕率等方面分析兩種標(biāo)記的效果，以期為花斑裸鯉等高原魚類的增殖放流標(biāo)記技術(shù)的選擇提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究使用的花斑裸鯉魚苗為青海省漁業(yè)技術(shù)推廣中心例行放流用魚苗，體長規(guī)格5～6 cm，在青海省漁業(yè)技術(shù)推廣中心池塘內(nèi)養(yǎng)殖，經(jīng)檢疫無病、無殘、無異常。

使用材料有可見植入熒光標(biāo)記、金屬線碼標(biāo)記(青島海星儀器有限公司)。MS-222麻醉藥、測量板/尺、電子秤、乙醇、剪刀、紗布、魚缸、溫度計、熒光手電筒、磁性金屬探測器等。

1.2 標(biāo)記方法

1.2.1 熒光標(biāo)記材料的配置及標(biāo)記方法

首先將熒光染色劑和硅油按10∶1比例在20 mL的注射器內(nèi)混合均勻后再注入0.5 mL注射器內(nèi)以備標(biāo)記(60 min內(nèi)全部使用完畢，以免固化)。注射熒光劑時將針頭緩慢插入花斑裸鯉背鰭基部前緣，挑起背鰭基部前緣皮膚，再將針頭推入約1 cm，在緩慢拔出針頭的同時推入熒光劑，肉眼可清晰觀察到熒光染色劑，長度約1 cm，回捕后可用熒光手電筒檢測(圖1)。

1.2.2 金屬線碼標(biāo)記方法

使用由青島海星儀器有限公司提供的金屬線碼標(biāo)記儀，將有編碼的磁性金屬絲(長1.10 mm、直徑0.25 mm)植入花斑裸鯉頭部表皮下[11]，回捕后可用磁性金屬探測器(V-Detector;NMT)檢測(圖1)。

圖1 熒光標(biāo)記和金屬線碼標(biāo)記位置示意圖

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

1.3.1 魚苗存活及標(biāo)記保持實(shí)驗(yàn)

2018年4月，選規(guī)格基本一致的花斑裸鯉共900尾，分成對照組、金屬絲標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和可見植入熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組，每組實(shí)驗(yàn)用魚300尾，下設(shè)三個重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對于對照組，每100尾魚直接放入實(shí)驗(yàn)用魚缸(100 cm×50 cm×20 cm，配充氧過濾設(shè)備)暫養(yǎng)。對于實(shí)驗(yàn)組，用0.3 mg/L的MS-222丁香芬試劑對魚苗進(jìn)行麻醉，采用可見植入熒光標(biāo)記和金屬絲標(biāo)記對魚苗進(jìn)行標(biāo)記，每100尾放入同樣條件的魚缸內(nèi)，每日給3組9個魚缸內(nèi)的魚苗投喂商品飼料，連續(xù)50 d觀察并記錄死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測量體長和體重等生長性狀數(shù)據(jù)，并使用熒光手電筒和磁性金屬探測器對標(biāo)記進(jìn)行檢測。

1.3.2 標(biāo)記放流

2018年6月1-6日對花斑裸鯉魚苗正式標(biāo)記，除了增加標(biāo)記數(shù)量外，標(biāo)記過程與對比實(shí)驗(yàn)標(biāo)記方法相同，標(biāo)記完成后放流到拉西瓦水庫。通過計算相同時間內(nèi)標(biāo)記的魚苗尾數(shù)對兩種方法的標(biāo)記效率進(jìn)行評估。同一人進(jìn)行兩種方法的標(biāo)記，每種方法各選標(biāo)記30尾，掌握方法后，計算同一人在10 min內(nèi)用兩種方法標(biāo)記的魚苗數(shù)量。

1.3.3 回捕檢測

考慮到回捕監(jiān)測時魚苗較小，魚苗活動區(qū)域主要在水庫周邊，為避免傷害，采用地籠進(jìn)行回捕。2018-2020年連續(xù)三年在拉西瓦水庫實(shí)施監(jiān)測，每年的監(jiān)測時間為7-10月。在拉西瓦水庫周邊的20處淺水水域設(shè)置地籠，地籠長度20 m，網(wǎng)目0.5 cm,回捕魚苗放入小網(wǎng)箱2 m×2 m×2 m暫養(yǎng)，檢測時用撈海打入盆中，使用熒光手電筒和磁性金屬探測器進(jìn)行標(biāo)記檢測。

1.4 統(tǒng)計分析

通過方差分析(由于體長體重數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，因此，本研究中采用Kruskal-Wallis方法)檢驗(yàn)標(biāo)記組與對照組的體長和體重是否存在顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)記魚苗存活率和標(biāo)記保持率

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，未標(biāo)記組花斑裸鯉魚苗生長狀況良好，存活率為100%。可見植入熒光標(biāo)記組的花斑裸鯉魚苗的生長狀況良好，平均存活率為(96.58±2.42)%，經(jīng)熒光手電筒檢測，標(biāo)記保持率為100%。金屬線碼標(biāo)記組的花斑裸鯉魚苗的生長狀況良好，平均存活率為(83.22±0.62)%，經(jīng)磁性金屬探測器檢測，標(biāo)記保持率為85%。

2.2 標(biāo)記對魚類生長的影響

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，對照組平均體長為(53.02±4.56) mm,平均體重為(2.07±0.56) g。金屬線碼組的平均體長為(54.30±5.13) mm,平均體重為(2.04±0.78) g。熒光標(biāo)記組的平均體長為(53.80±4.71) mm,平均體重為(1.94±0.58) g。Kruskal-Wallis方法對比顯示，標(biāo)記組與對照組間的體長和體重均沒有顯著差異，表明兩種標(biāo)記均未對花斑裸鯉的生長產(chǎn)生不利影響(圖2)。

圖2 不同標(biāo)記方法及對照組魚類體長體重變化

2.3 標(biāo)記數(shù)量和效率

通過6 d標(biāo)記，利用可見植入熒光累計標(biāo)記魚苗15 695尾，利用金屬線碼累計標(biāo)記魚苗6 565尾。可見植入熒光標(biāo)記方法相對簡單，可多人同時標(biāo)記，標(biāo)記速度5～10秒/(尾·人)，金屬線碼標(biāo)記操作難度相對較高，標(biāo)記速度20～25秒/(尾·人)，單人標(biāo)記速度可見植入熒光標(biāo)記法是金屬線碼標(biāo)記法的約3倍。

2.4 回捕檢測

共標(biāo)記花斑裸鯉魚苗22 260尾，在拉西瓦水域共計放流20萬尾，標(biāo)記魚苗約占11.13%。2018年7月，共回捕花斑裸鯉3 802尾，熒光標(biāo)記177尾，回捕率為1.13%；金屬線碼標(biāo)記26尾，回捕率為0.40%。熒光標(biāo)記回捕率顯著高于金屬線碼標(biāo)記。2019年回捕到2018年熒光標(biāo)記魚類30尾，金屬線碼標(biāo)記魚類1尾，2020年回捕到2018年熒光標(biāo)記魚類3尾，金屬線碼標(biāo)記魚類0尾。2019年金屬線碼可檢測信號強(qiáng)烈，2019-2020年度回捕熒光標(biāo)記個體標(biāo)記顯示清晰。

3 討論

目前，根據(jù)標(biāo)記的性質(zhì)主要分為三類，即物理標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記[6]。物理標(biāo)記包括金屬絲、PIT(Passive Integrated Transponder)芯片、掛牌、切鰭等，此標(biāo)記技術(shù)利用肉眼或掃描器識別標(biāo)記，是直觀、常用的標(biāo)記技術(shù)。楊德國等[12]采用外掛銀牌和金屬線碼雙重標(biāo)記，對中華鱘幼魚進(jìn)行標(biāo)記，研究了人工繁殖中華鱘的降河洄游特性。化學(xué)標(biāo)記如熒光標(biāo)記等是將化學(xué)物質(zhì)植入魚的表面或體內(nèi)，通過肉眼或檢測器識別標(biāo)記，也是常用的放流標(biāo)志技術(shù)。胡夢紅等[13]在西背嶺潮間帶使用可視嵌入性熒光標(biāo)記對放流的中國鱟進(jìn)行標(biāo)志，通過回捕分析，獲得標(biāo)記稚鱟的分布區(qū)域，并得出稚鱟擴(kuò)散能力。分子標(biāo)記是直接以DNA的形式表現(xiàn)，其技術(shù)原理是子代的等位基因從父母本遺傳獲得，依據(jù)等多個基因座分析可以對個體的父母本進(jìn)行鑒定和區(qū)分。成為為等[14]利用微衛(wèi)星標(biāo)記推算出增殖放流的胭脂魚對長江中上游野生群體的貢獻(xiàn)量為16.92%。但是，各類標(biāo)記都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，物理標(biāo)記中掛牌和PIT芯片等標(biāo)記可能會隨著魚類活動而脫落，且影響魚類生長；切掉的魚鰭會隨著魚類生長而得到補(bǔ)充；化學(xué)標(biāo)記可能隨著時間慢慢變淡或消失；分子標(biāo)記的效果與親魚和自然群體的遺傳背景有關(guān)[15]。因此，應(yīng)根據(jù)魚類自身特性通過對比研究確定合適的標(biāo)記方法。本研究室內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，可見植入熒光標(biāo)記方法的效率更高，標(biāo)記后在花斑裸鯉上的保持率達(dá)100%，成活率達(dá)(96.58±2.42)%，而金屬線碼標(biāo)記保持率僅為85%，成活率(83.22±0.62)%。金屬線碼標(biāo)記保持率較低和死亡率較高的主要原因可能是受金屬探測器靈敏度和標(biāo)記儀器操作便利性限制。為便于后期金屬探測儀探測，花斑裸鯉金屬線碼標(biāo)記最佳位置位于其頭部很薄的皮膚下，且不宜過深，標(biāo)記過程容易對其造成傷害，且金屬線本身比較光滑，在表皮下容易滑動，不利于標(biāo)記的保持。而可見植入熒光標(biāo)記物有一定粘性在背鰭基部表皮下附著力較好。

兩種標(biāo)記方法的標(biāo)記組與對照組間的體長與體重均沒有顯著差異，表明標(biāo)記未對花斑裸鯉生長產(chǎn)生不利影響，與其他魚類標(biāo)記研究結(jié)果相似。兩種標(biāo)記方法均被認(rèn)為是很安全的[9,17]，但如果魚類個體很小(體重<1 g)死亡率會增加[17]。本研究放流的花斑裸鯉魚苗平均體重在5～10 g，因此標(biāo)記并未對其生長或身體狀況產(chǎn)生不利影響。

從放流回捕后識別度來看，可見植入熒光標(biāo)記比金屬線碼標(biāo)記的更容易識別。花斑裸鯉全身裸露而僅臀鱗及肩帶部分有少數(shù)不規(guī)則的大型鱗片，熒光標(biāo)記在裸露的皮膚下更易觀察。在室內(nèi)光線較暗的情況下，可見植入熒光標(biāo)記的魚苗可以通過肉眼直接觀察，熒光手電筒可一次識別多尾魚，并且可以通過不同顏色的熒光劑區(qū)分不同年份標(biāo)記的魚類，而金屬線碼需要在低倍顯微鏡下觀察特殊編碼才能予以區(qū)分年份，效率相對較低。2018-2020年連續(xù)3年監(jiān)測都可以回捕到可見植入熒光標(biāo)記的魚類，且標(biāo)記依然清晰，效果穩(wěn)定。回捕數(shù)量逐年下降的原因主要是隨著標(biāo)記魚苗的生長，其活動范圍變廣，多數(shù)進(jìn)入水庫深水區(qū)，捕捉難度明顯增大，可能也有自然死亡的原因，今后應(yīng)進(jìn)一歩加大標(biāo)記數(shù)量。

以上分析表明，可見植入熒光標(biāo)記的效率高、成本低、操作便利、成活率高、回捕檢出率高、標(biāo)記保持時間長、各項指標(biāo)優(yōu)于金屬線碼標(biāo)記方法，較易應(yīng)用于花斑裸鯉增殖放流效果評估，效果比較好。花斑裸鯉生長和發(fā)育都比較緩慢，放流稚魚個體較小，不適合用掛牌和PIT等較大標(biāo)記[18]；花斑裸鯉為四倍體魚，較難使用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行親權(quán)關(guān)系鑒定[19]。因此，我們建議采用可見植入熒光標(biāo)記作為花斑裸鯉標(biāo)記方法。此外，鑒于裂腹魚亞科中裸鯉屬、裸裂尻魚屬、高原魚屬、裸重唇魚屬等具有與花斑裸鯉相似的生物學(xué)特性，因此，此方法也可推廣應(yīng)用于其他裂腹魚類的標(biāo)記放流，應(yīng)用前景廣闊。