高通量測序在兒童重癥肺炎病原學診斷中的應用*

邱梅冰，楊 彤

廣西壯族自治區柳州市人民醫院兒科，廣西柳州 545006

兒童肺炎是5歲以下兒童死亡的最主要原因之一[1-2]，而重癥肺炎具有復雜性、缺乏可預測性等特點，且常涉及其他器官的功能障礙，因此具有更高的病死率。早期應用有效的抗感染治療方案可以改善患兒的預后，而精準的抗感染治療方案有賴于病原體的檢測。迄今為止，兒童重癥肺炎感染源的識別仍然是臨床的一個主要難題。檢測病原體的標本包括血液、咽拭子、痰液及支氣管肺泡灌洗液，其中支氣管肺泡灌洗液標本的檢測常用于重癥肺炎患兒的微生物檢查[3]。本科室自2019年1月以來征得患兒家長同意后對重癥肺炎患兒的肺泡灌洗液實行高通量測序病原體檢測，實現了對重癥肺炎病原體的精準診斷，為臨床抗感染治療方案的制訂提供了精準的依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1月至2020年1月在本院兒科住院的99例重癥肺炎患兒作為研究對象，其中男53例，女46例；年齡1個月至14歲，中位年齡3歲2個月；所有患兒均已在門診及基層醫院給予口服及靜脈抗菌藥物治療，入院后均給予經驗性抗感染治療，病原學檢測結果回報后根據病情調整抗感染治療方案；13例應用呼吸機輔助通氣治療，3例使用體外膜肺氧合(ECMO)循環支持治療；經抗感染及對癥支持治療后，97例患兒好轉出院，2例死亡。納入標準：所有患兒診斷均符合《兒科學》第9版兒童重癥肺炎的診斷標準[4]；家屬均簽署知情同意書，書面同意進行支氣管鏡及高通量測序等檢查；患兒均有支氣管鏡檢的適應證，無禁忌證[5]。

1.2方法 患兒入院第1天在開始經驗性抗感染治療前均進行常規檢測，包括血常規、超敏C反應蛋白、降鈣素原、肺炎支原體抗體滴度、咽拭子免疫熒光病毒(包括呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、副流感病毒1/2/3型、腺病毒)檢測以及血培養，根據病情選擇性進行真菌D-葡聚糖等檢測。入院后第2天或第3天行支氣管鏡檢查并采集肺泡灌洗液，每例標本分2份，1份送一般細菌涂片及培養檢查，另1份送高通量測序檢查。高通量測序標本交由深圳華大基因股份有限公司檢測，與該公司病原體數據庫進行比對，得出報告結果序列數。高通量測序結果判讀陽性的標準如下[6]：(1)在屬水平上，細菌(不包括結核分枝桿菌)和真菌的相對豐度大于30%；(2)如果至少有一個讀數在物種或屬水平上與參考基因組一致，則認為結核分枝桿菌呈陽性；(3)當嚴格的圖譜讀數(SMRN)不小于3時，認為病毒檢測呈陽性；(4)當用傳統的病原學檢測方法檢測到病原體，且高通量測序的序列數大于50時，也可以認為該病原體被檢出。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0統計學軟件對數據進行處理。計數資料以頻數、率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1傳統常規檢測結果 99例患兒中白細胞增高20例(18例以中性粒細胞升高為主，2例以淋巴細胞升高為主)，白細胞下降7例；超敏C反應蛋白增高72例；降鈣素原增高47例；真菌D-葡聚糖陽性6例；檢出病原體66例(66.67%)，其中單一病原體55例，混合病原體11例。臨床傳統病原學檢測檢出細菌24例(24.24%)，其中痰培養檢出17例(17.17%)，血培養檢出4例(4.04%)，痰培養及血培養均檢出3例(3.03%)；肺炎支原體抗體滴度檢測檢出肺炎支原體55例(55.56%)；咽拭子檢測檢出病毒8例(8.08%)。

2.2肺泡灌洗液涂片及細菌培養結果 肺泡灌洗液涂片檢出病原體36例(36.36%)，分別為革蘭陽性球菌25例(25.25%)，革蘭陰性桿菌1例(1.01%)，革蘭陽性球菌及陰性桿菌混合9例(9.09%)，真菌孢子1例(1.01%)。肺泡灌洗液細菌培養檢出16例，分別為流感嗜血桿菌7例，肺炎鏈球菌4例，肺炎克雷伯菌2例，銅綠假單胞菌1例，鮑曼不動桿菌1，嗜麥芽單胞菌1例。

2.3肺泡灌洗液高通量測序病原體檢出結果 肺泡灌洗液高通量測序檢出病原體97例(97.98%)，包括單一細菌10例，單一病毒17例，單一支原體28例，混合病原體42例(混合有細菌的38例；混合有病毒的25例，混合有肺炎支原體的20例)。檢出的細菌為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌，病毒為腺病毒及巨細胞病毒，混合病原體中有腺病毒7型、肺炎支原體、緩征鏈球菌、肺炎鏈球菌、產黑色普雷沃菌、嗜血桿菌、煙曲霉。

2.3.1肺泡灌洗液細菌培養與高通量測序細菌檢出結果比較 99例肺泡灌洗液標本中，細菌培養檢出細菌16例(16.16%)，高通量測序檢出細菌48例(48.48%)，2種檢測方法均檢出細菌12例(12.12%)。肺泡灌洗液高通量測序的細菌檢出率高于細菌培養的細菌檢出率(P<0.05)，見表1。

表1 肺泡灌洗液細菌培養與高通量測序細菌檢出結果比較(n)

2.3.2咽拭子和肺泡灌洗液高通量測序病毒檢出結果比較 99例咽拭子標本中檢出病毒8例(8.08%)，肺泡灌洗液高通量測序檢出病毒42例(42.42%)，2種檢測方法均檢出病毒5例(5.05%)。肺泡灌洗液高通量測序的病毒檢出率高于咽拭子的病毒檢出率(P<0.05)，見表2。

表2 咽拭子和肺泡灌洗液高通量測序病毒檢出結果比較(n)

2.3.3血清肺炎支原體抗體滴度檢測與肺泡灌洗液高通量測序肺炎支原體檢出結果比較 肺炎支原體抗體滴度檢測，99例患兒中檢出肺炎支原體55例(55.56%)，肺泡灌洗液高通量測序檢出肺炎支原體48例(48.48%)，2種檢測方法均檢出肺炎支原體36例(36.36%)。肺泡灌洗液高通量測序的肺炎支原體檢出率低于血清肺炎支原體抗體滴度檢測的檢出率，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 血清肺炎支原體抗體滴度檢測與肺泡灌洗液高通量測序肺炎支原體檢出結果比較(n)

2.3.4傳統培養方法與高通量測序真菌檢出結果比較 血液、痰、肺泡灌洗液標本傳統培養均未檢出真菌，高通量測序檢出真菌4例，主要為煙曲霉。

3 討 論

重癥肺炎是兒科常見危重疾病，由于其病情進展迅速、并發癥多，可累及多系統多器官，在臨床上有較高的病死率。重癥肺炎的常見病原體包括細菌、病毒、真菌、支原體等，重癥肺炎可由單一病原體引起，也可由混合病原體引起。盡快明確引起重癥肺炎的病原體是實現精準抗感染治療的前提。盡管有全面的檢測方法，但高達60%的患兒沒有檢測到病原體[7]。在病原體未明前，經驗性使用抗菌藥物通常作為最初的抗感染治療。經驗性抗菌藥物治療通常缺乏針對性，廣譜抗菌藥物可能導致抗菌藥物耐藥性的出現；如為病毒感染，則導致不必要的廣譜抗菌藥物使用，誘導抗藥性，并增加醫療成本。目前臨床上采用的傳統病原學檢測方法包括病原體培養、抗原抗體檢測等。目前這些傳統的病原體檢測技術均無法為臨床精準的抗感染治療提供依據，臨床上迫切需要一種可以較快速且精準的病原學檢測手段。

近年來隨著高通量測序技術的發展，人們能夠檢測、鑒定甚至量化定值在人類消化道或呼吸管腔的原核或真核微生物群落。高通量測序技術，其原理在于直接從臨床標本中提取全部病原體的DNA或RNA，利用基因組學的研究策略研究標本中所包含的全部病原體的遺傳組成及其群落功能，通過同源序列比對以篩查鑒定病原體。這種方法不需要病原體的分離培養，可實現在數小時到數天的單一測序過程中從許多樣本中產生數據,不僅有效地克服了現有分子診斷技術的缺陷，還為多種病原體(尤其是真菌和病毒)混合感染的檢測開辟了新的技術路徑[8]。高通量測序技術從引入臨床應用后即取得了令人矚目的成績[9-12]。高通量測序技術在呼吸系統病原學診斷和鑒定中的應用，特別是在重癥肺炎和不明原因感染患兒中的應用越來越廣泛。

細菌仍是目前重癥肺炎的常見病原體。傳統的細菌培養仍然被視為診斷細菌感染的金標準，但它很費時，陽性率不高，而且僅限于特定的病原體檢測，并非所有病原體都可以培養。本研究顯示，肺泡灌洗液高通量測序細菌檢出率為48.48%，高于傳統細菌培養方法的細菌檢出率(16.16%)，差異有統計學意義(P<0.05)，高通量測序使細菌檢出率提高了近2倍。本研究中所有肺泡灌洗液的采集均在使用抗菌藥物治療后1～2 d，提示高通量測序結果不受到先前抗菌藥物使用的影響，這與PARIZE等[13]的研究結果一致。高通量測序在混合細菌檢出方面也表現良好[8]，本研究中檢出混合細菌感染，這是傳統細菌培養所不能的。根據高通量測序結果可優化治療方案和減少藥物不良反應，甚至減少醫療費用。

由病毒引起的呼吸道感染是全球人類最常見的疾病之一，病毒不僅能引起輕微的上呼吸道感染，也能引起重癥肺炎。而由新型冠狀病毒引起的新型冠狀病毒肺炎至今仍未得到完全控制，其對全球公共衛生存在巨大威脅[14]。快速和準確地識別病原體，對于選擇適當的治療方法，挽救人們的生命，控制流行病，以及避免不必要地使用抗菌藥物很重要。病毒分離培養是診斷病毒感染的金標準,但其靈敏度和特異度差，且費時費力，需要有經驗的技術人員進行分析，結果仍不確定，臨床上不易開展。常規診斷檢測，例如用于快速檢測病毒抗體或病毒抗原的測定方法，已在許多臨床實驗室中廣泛應用。本研究提示，咽拭子病毒檢出率為8.08%，而肺泡灌洗液高通量測序的病毒檢出率為42.42%，較常規檢測方法明顯升高(P<0.05)。有研究發現病毒合并細菌感染患者的病死率增高[15]，從而突出了快速診斷細菌共感染或重疊感染的重要性。高通量測序在檢測病毒合并細菌感染方面顯示出巨大的優勢[16]。本研究中混合病原體感染有42例，這些病例在高通量測序結果回報后加用針對性抗感染藥物治療后病情得到改善。本研究中2例死亡患兒為腺病毒感染，發生于2019年腺病毒流行季節，初期臨床醫師對該疾病認識不足，進行肺泡灌洗液高通量測序后明確患兒病原體，調整治療方法，隨后發病率及病死率均降低。

肺炎支原體是兒童社區獲得性肺炎的主要病因。近年來，與肺炎支原體相關的重癥肺炎病例的報道越來越多[17]。肺炎支原體抗體滴度檢測是目前許多基層醫院最常用的方法，但這種方法在對不同發病時期采集的血清樣本以及使用不同的商業檢測試劑盒進行檢測時，會產生不一致的結果，具有較高的假陰性率和假陽性率。對某些患兒來說，由于肺炎支原體抗體可持續存在很長時間，故很難確認患兒當前是否存在肺炎支原體現癥感染[18]。本研究顯示，肺炎支原體抗體滴度檢測肺炎支原體檢出率為55.56%，而高通量測序檢出率為48.48%，即高通量測序法肺炎支原體檢出率較肺炎支原體抗體滴度檢測的檢出率低，與李學清等[19]的研究結果一致。但高通量測序通過檢測肺炎支原體的序列數可明確是否為現癥感染，還可顯示肺炎支原體與其他病原體的共患感染，這是常規檢測方法無法實現的。

此外，本研究采用高通量測序檢出4例真菌，主要為煙曲霉，而傳統病原學檢測均未檢出真菌。DECKER等[20]對50例真菌膿毒癥患兒在其發病后的28 d內連續6個時間點進行了真菌培養、高通量測序，并對血漿β-D-葡聚糖、γ-干擾素、腫瘤壞死因子等指標進行檢測，結果提示，高通量測序的診斷方法適用于真菌膿毒癥患兒和血培養陰性患兒的真菌病原體鑒定，可彌補常規培養診斷的空白。同時，已證實高通量測序在檢測真菌感染方面存在可行性[7]，可為臨床及時抗真菌治療提供重要依據，對改善患兒預后、搶救患兒生命起到非常重要的作用。高通量測序能幫助臨床醫生快速、準確地診斷原因不明的呼吸系統疾病，但也存在許多挑戰，如缺乏通用的結果分析標準和通用的報告解釋指南，同時背景病原體與真實病原體的鑒別仍然是臨床需要解決的問題[21]。目前高通量測序的成本仍較高(3 500元/例)，需注意選擇合適的患兒進行檢測。

綜上所述，高通量測序能快速、準確地檢測和鑒定病原體，有助于及時、準確地治療兒童重癥肺炎。隨著醫學發展，高通量測序有望為臨床兒童重癥肺炎精確診斷和治療提供重要依據。