不同檢測方法在結(jié)核病利福平耐藥快速診斷中的臨床應(yīng)用研究*

包訓(xùn)迪，王 慶，王 舒，徐東芳，梁 鎖，江 躍

安徽省胸科醫(yī)院/安徽省結(jié)核病防治研究所檢驗科，安徽合肥 230022

結(jié)核病是一種全球感染人數(shù)最多，經(jīng)呼吸系統(tǒng)傳播的疾病，已成為全球十大死亡原因之一。近年來，隨著耐藥結(jié)核病的日益增多，結(jié)核病的疫情防控工作從各方面都面臨著巨大挑戰(zhàn)[1-2]。根據(jù)我國第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查和第1次耐藥結(jié)核病基線調(diào)查數(shù)據(jù)[3-4]，我國每年大約新發(fā)結(jié)核病患者約93萬人，估算耐多藥結(jié)核病患者約5.2萬人[5]。有研究指出，耐利福平(RFP)患者大部分為耐多藥結(jié)核病患者，因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)在耐多藥結(jié)核病患者中發(fā)現(xiàn)，近期耐RFP患者即可按照耐多藥結(jié)核病患者進(jìn)行治療。耐藥結(jié)核病的診斷主要依賴于結(jié)核分枝菌藥物敏感(簡稱藥敏)試驗，傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)藥敏試驗是目前診斷耐藥結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但傳統(tǒng)藥敏試驗時間長，影響耐藥結(jié)核病的防控、及時診斷和治療工作。因此，結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的早期快速診斷對結(jié)核病疫情控制起著至關(guān)重要的作用。

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥基因的快速檢測均有成熟易用的技術(shù)在推廣使用。多色熔解曲線分析(MMCA)法為我國自主研發(fā)技術(shù)，可同時進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和多種抗結(jié)核藥物的快速檢測[6-7]；Gene-Xpert法為WHO推廣使用的快速檢測技術(shù)，同樣可同時進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥基因的檢測。這兩種方法均為DNA擴(kuò)增檢測技術(shù)，具有操作相對簡單、靈敏度高、特異度高等特點[8-9]。微孔板(MIC)法是近幾年報道的一種細(xì)菌學(xué)藥敏檢測方法，利用MIC中加入抗結(jié)核藥物進(jìn)行藥敏檢測，可縮短耐藥檢測時間[10]。本研究采用這3種檢測方法對肺結(jié)核患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥的快速診斷，以評估這3種檢測方法在結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥快速診斷中的檢測效能，進(jìn)一步分析其在結(jié)核病和耐藥結(jié)核病控制中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年1-7月在本院就診的300例肺結(jié)核患者作為研究對象。300例患者中男214例，平均年齡(49.72±19.12)歲；女86例，平均年齡(43.77±20.06)歲。

1.2儀器與試劑 Gene-Xpert法檢測儀器GeneXpert及配套試劑盒購自美國Cepheid公司，MMCA法結(jié)核分枝桿菌耐藥突變檢測儀器SLAN-96S及配套試劑盒購自廈門致善生物科技有限公司，MIC法結(jié)核藥敏檢測儀器YK960及配套試劑盒購自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集肺結(jié)核患者的痰或肺泡灌洗液標(biāo)本，按照結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作流程采用MMCA法、Gene-Xpert法檢測RFP耐藥性，同時進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株再進(jìn)行MIC法檢測RFP耐藥性。

1.3.2結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥檢測方法 (1)MMCA法：取標(biāo)本1～2 mL，加入1～2倍標(biāo)本前處理液處理，以12 000×g離心15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸后洗滌，12 000×g離心5 min，棄上清液，加入核酸提取液，上核酸提取儀進(jìn)行核酸提取，提取后的DNA按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測，由儀器根據(jù)核酸解鏈溫度自動判讀結(jié)果。(2)Gene-Xpert法：取待檢標(biāo)本2 mL，加入1～2倍標(biāo)本前處理液處理，消化處理15 min后，按照試劑盒操作說明書進(jìn)行操作，由儀器自動判讀結(jié)果，結(jié)核分枝桿菌半定量檢測結(jié)果分為陰性、極低、低、中、高5個菌量級別，RFP耐藥檢測結(jié)果分為耐藥、敏感。(3)MIC法檢測：取患者1～2周內(nèi)培養(yǎng)陽性菌株，根據(jù)操作說明書，將菌株進(jìn)行比濁定量，加入MIC相應(yīng)藥敏檢測位置，37 ℃培養(yǎng)10～14 d后，由儀器判讀藥敏試驗結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.13種檢測方法結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果 采用MMCA法、Gene-Xpert法、MIC法對300例肺結(jié)核患者標(biāo)本進(jìn)行檢測，MMCA法獲得132例藥敏試驗結(jié)果，Gene-Xpert法獲得192例藥敏試驗結(jié)果，MIC法獲得201例藥敏試驗結(jié)果。3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的患者有77例，其中有63例繼發(fā)性肺結(jié)核、12例空洞型肺結(jié)核、2例浸潤性肺結(jié)核；40例為復(fù)治結(jié)核病患者。3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果

2.2不同性別患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥情況比較 3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的77例患者中，男53例，女24例。不同性別患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同性別患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥情況比較[n(%)]

2.3不同年齡組患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥情況比較 將3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的77例患者分為≤25歲、>25～50歲、>50歲3個年齡組。不同年齡組患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4不同菌量標(biāo)本3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥情況比較 將3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的77例患者標(biāo)本按照菌量分為高、中、低、極低菌量4個級別，不同菌量標(biāo)本3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同菌量3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥情況比較[n(%)]

3 討 論

自我國開始結(jié)核病的規(guī)范化管理治療以來，結(jié)核患者一直能夠得到國家規(guī)范化的免費抗結(jié)核治療。雖然經(jīng)過近20年的規(guī)范化管理治療，但我國的結(jié)核病患者數(shù)量并沒有明顯下降，目前居全球第2位。隨著實驗室檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的耐藥結(jié)核病患者被發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌耐藥株的傳播也導(dǎo)致了我國耐藥結(jié)核病患者數(shù)量居高不下[11]，使我國成為全球耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。RFP是目前結(jié)核病治療中最常用，也是最重要的一種藥物。根據(jù)WHO的推薦，耐RFP的結(jié)核病患者可按照耐多藥結(jié)核病患者進(jìn)行治療，因此，RFP耐藥情況檢測在肺結(jié)核患者中至關(guān)重要。

本研究中，3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的患者有77例，其中有63例繼發(fā)性肺結(jié)核、12例空洞型肺結(jié)核、2例浸潤性肺結(jié)核；40例為復(fù)治結(jié)核病患者。由于本院是省級結(jié)核病定點醫(yī)院，收治的多是復(fù)治、耐藥結(jié)核病患者，故本研究中RFP耐藥率高于全國平均水平，但與全國復(fù)治結(jié)核患者RFP耐藥率基本一致[4]。

目前，常見的實驗室結(jié)核分枝桿菌耐藥株檢測方法有傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)藥敏檢測技術(shù)、液體藥敏檢測技術(shù)、分子生物學(xué)耐藥快速篩查等技術(shù)[12-15]。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)藥敏檢測技術(shù)的缺點是耗時長，但液體藥敏檢測技術(shù)縮短了這一時間，MIC法僅需7～10 d即可報告藥敏試驗結(jié)果。而分子生物學(xué)方法1 d內(nèi)即可獲得藥敏檢測結(jié)果，常用的分子生物學(xué)檢測技術(shù)有MMCA法、Gene-Xpert法、線性探針、基因芯片等，它們主要通過檢測結(jié)核分枝桿菌的特異性靶基因是否存在基因突變來評估結(jié)核分枝桿菌對相應(yīng)藥物的耐藥性，而且自動化程度高，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)藥敏試驗結(jié)果基本一致，故在臨床逐漸被接受和推廣。

本研究結(jié)果顯示，MMCA法檢測結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率最高，MIC法次之，Gene-Xpert法最低，但三者的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而且在不同性別和年齡段患者中，結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率差異也均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對于分子生物學(xué)檢測，菌量是不可忽視的一個問題，含菌量低的標(biāo)本可能導(dǎo)致核酸提取的假陰性；而含菌量高的標(biāo)本，因野生型模板背景較高時，易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。這些原因都可能導(dǎo)致表型藥敏試驗和分子藥敏試驗結(jié)果不一致。基于核酸的堿基突變檢測也不能完全覆蓋所有的基因突變位點，也有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的存在。因此，可以利用分子藥敏試驗和表型藥敏試驗互補(bǔ)的檢測方法進(jìn)行藥敏試驗篩查，提高檢測靈敏度和特異度。本研究中結(jié)果顯示，不同菌量標(biāo)本3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能與樣本量較少有關(guān)，后期可以加大樣本量進(jìn)行研究，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)分子藥敏試驗和表型藥敏試驗之間的差異。

MMCA法和Gene-Xpert法均是通過檢測RFP的rpoB基因上的507～533共81 bp耐藥決定區(qū)的基因序列，通過檢測堿基突變來確定RFP的耐藥信息，與傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)藥敏試驗相比，有較好的一致性，且靈敏度和特異度均較高，能夠在短時間內(nèi)檢測出RFP的耐藥基因rpoB的突變信息。MIC法是通過抗結(jié)核藥物技術(shù)處理后按照一定的藥物濃度加入MIC中，再加入一定量的結(jié)核分枝桿菌，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，從而判斷結(jié)核分枝桿菌是否對該藥物耐藥的一種新型細(xì)菌學(xué)耐藥檢測技術(shù)[16]。該方法受MIC加工工藝和藥粉質(zhì)量的影響，對藥敏試驗結(jié)果可能會存在一定的影響，因此，目前應(yīng)加強(qiáng)MIC的質(zhì)量控制工作。本研究在藥敏試驗檢測過程中，參加了中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室的藥敏試驗室間質(zhì)量控制，取得了優(yōu)秀成績，但此次質(zhì)量控制覆蓋的藥物種類較少，主要是常見的抗結(jié)核藥物，質(zhì)量控制藥物較少，這也是結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗檢測室間質(zhì)量控制的發(fā)展方向。

此外，MMCA法、Gene-Xpert法、MIC法3種方法在檢測時間、檢測費用、人力成本方面也有區(qū)別，3種方法都是結(jié)核分枝桿菌的新檢測技術(shù)，需要經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作。MMCA法和Gene-Xpert法是分子生物學(xué)檢測技術(shù)，檢測時間均短于細(xì)菌學(xué)檢測技術(shù)MIC法；檢測費用Gene-Xpert法最高，MIC法最低。這3種方法需要臨床醫(yī)生根據(jù)患者病情和其他多方面因素進(jìn)行選擇，并可在耐多藥結(jié)核病防治領(lǐng)域中進(jìn)行推廣和應(yīng)用[17]。

綜上所述，MMCA法、Gene-Xpert法和MIC法在臨床上檢測結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥性結(jié)果無明顯差異，均具有較高的靈敏度和特異度，可結(jié)合臨床實際需求選擇藥敏檢測技術(shù)。