金黃色葡萄球菌基因檢測(cè)及耐藥性分析*

王 歡,胡 垚,陸惠慧,秦玲莎,趙貴芳,齊 玲,徐令清

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院臨床生物樣本庫(kù)，廣東清遠(yuǎn) 511518

2019年清遠(yuǎn)地區(qū)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示金黃色葡萄球菌(SA)占本地區(qū)革蘭陽(yáng)性菌分離率的第一位，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)占多重耐藥菌檢出率的32.6%,耐藥菌是院內(nèi)外感染的重要病原菌之一，是世界范圍內(nèi)耐藥性監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)對(duì)象，其流行是一個(gè)嚴(yán)重的臨床醫(yī)學(xué)及公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。本研究對(duì)本院臨床分離的80株非重復(fù)SA進(jìn)行耐藥性分析及基因檢測(cè)，為臨床合理治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集從2018年7月至2019年7月清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床檢測(cè)分離到的SA菌株，菌株均來(lái)自不同科室患者的臨床標(biāo)本，包括膿液、血液、穿刺液、痰液、引流液等，剔除出重復(fù)菌株，最后納入研究的SA共80株。SA質(zhì)控菌株：ATCC25923，ATCC29213，ATCC43300。

1.2儀器與試劑 儀器：BD PhoenixTM100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)、復(fù)合鑒定板及相關(guān)配套試劑均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，生物安全柜ESCO LA2-4A1來(lái)自新加坡藝思高科技有限公司，基因擴(kuò)增儀Bio-Rad T100、電泳儀、凝膠成像儀Bio-Rad ChemiDoc MP均來(lái)自美國(guó)伯樂(lè)公司，微量移液器Eppendorf來(lái)自德國(guó)艾本德公司。試劑：血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣州迪景微生物科技有限公司； TaqPCRMaster Mix試劑、MarkerⅡDNA Ladder、核酸染料GelRed等均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1SA鑒定及藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)菌株經(jīng)哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)革蘭染色和觸酶試驗(yàn)證實(shí)后，用傳統(tǒng)畫線法接種于血瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，用PhoenixTM100全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏試驗(yàn)系統(tǒng)以及紙片擴(kuò)散法鑒定細(xì)菌并進(jìn)行藥敏檢測(cè)，鑒定后的菌株保存于-80 ℃冰箱備用。藥敏試驗(yàn)嚴(yán)格遵守臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)研究所/美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI/NCCLS)2017年操作及判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。采用紙片擴(kuò)散法將SA配置為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?1.5×108CFU/mL)，接種于MH 瓊脂培養(yǎng)基上，貼入30 μg頭孢西丁紙片，培養(yǎng)后測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑≤19 mm確定為MRSA。

1.3.2菌株收集和保存 將鑒定出的SA置于裝有純牛奶的無(wú)菌EP管中，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3DNA模板制備 將保存菌株復(fù)蘇，接種于哥倫比亞血平板上，CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。挑取純分的新鮮SA菌落1～2個(gè),置于含200 μL TE緩沖液的5 mL Eppendorf管中混勻，然后于恒溫金屬浴中100 ℃加熱10 min，再以12 000 r/min離心1 min,取上清液作為SA的DNA模板。

1.3.4聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 采用25 μL體系：ddH2O 9.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，MIX 12.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；循環(huán)條件：94 ℃，30 s 、51 ℃(mecA) /50 ℃(mecC)/53 ℃[殺白細(xì)胞毒素(PVL)]/51 ℃(sasX)，30 s、72 ℃，50 s ，循環(huán)35次；延伸72 ℃，5 min；保存4 ℃。

1.3.5PCR引物 根據(jù)相應(yīng)文獻(xiàn)委托上海生物工程有限公司合成PCR引物[3]，詳見表1。

表1 PCR引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel365對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)、率表示。

2 結(jié) 果

2.1鑒定結(jié)果 80株SA中，MRSA 40株，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)40株。

2.2耐藥性分析 SA對(duì)青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率較高，分別為95.00%、55.00%、55.00%；未發(fā)現(xiàn)SA對(duì)利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、替考拉寧和替加環(huán)素耐藥；MRSA對(duì)青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸耐藥率均為100.00%，對(duì)克林霉素、紅霉素耐藥率均為75.00%，對(duì)甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、慶大霉素、利福平較敏感，耐藥率<17.50%，見表2。

表2 MRSA和MSSA對(duì)常見抗菌藥物的耐藥情況[%(n/n)]

2.3耐藥基因檢測(cè) 分別對(duì)80株臨床分離的SA菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳，結(jié)果顯示，80株SA均未檢測(cè)到mecC與sasX基因；在mecA基因檢測(cè)中，MSSA的陽(yáng)性率為20.00%(8/40)，MRSA的陽(yáng)性率為100.00%(40/40)，見圖1。

圖1 MRSA的mecA基因PCR擴(kuò)增圖

2.4PVL基因檢測(cè) 運(yùn)用PVL基因的PCR引物分別對(duì)80株臨床分離的SA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳，結(jié)果顯示，MSSA的PVL基因陽(yáng)性率為7.50%(3/40)，MRSA中有8株具有PVL基因的PCR擴(kuò)增陽(yáng)性條帶，陽(yáng)性率為20.00%(8/40)，見圖2。

圖2 MRSA的PVL基因PCR擴(kuò)增圖

3 討 論

清遠(yuǎn)市細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)于2019年成立，本監(jiān)測(cè)網(wǎng)要求網(wǎng)點(diǎn)醫(yī)院采用統(tǒng)一的藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用專業(yè)認(rèn)可的手工法或儀器法進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏檢測(cè)，獲取清遠(yuǎn)地區(qū)細(xì)菌耐藥特征及變遷信息，為臨床醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)選擇抗菌藥物提供參考，為政務(wù)、衛(wèi)生行政部分制定相關(guān)政策及評(píng)估干預(yù)措施的有效性提供科學(xué)依據(jù)。

本研究對(duì)本院近年來(lái)臨床科室送檢標(biāo)本分離出來(lái)的80株SA進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)SA對(duì)12種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果可看出，12種抗菌藥物當(dāng)中，SA對(duì)青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率較高，分別為95.00%、55.00%、55.00%，而MRSA對(duì)這3種抗菌藥物的耐藥率均為100.00%，由此可見，MRSA對(duì)青霉素類抗菌藥物的耐藥情況嚴(yán)重；80株SA對(duì)甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、慶大霉素、利福平較敏感，其中MRSA對(duì)三者的耐藥率分別為7.50%、17.50%、15.00%；80株SA未發(fā)現(xiàn)對(duì)利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、替考拉寧和替加環(huán)素耐藥。

80株SA中均未檢測(cè)到耐藥基因mecC與sasX，但是在mecA基因檢測(cè)中，MSSA的陽(yáng)性率為20.00%(8/40)，MRSA的陽(yáng)性率為100.00%(40/40)，提示本院臨床分離的MRSA主要為mecA介導(dǎo)。mecA基因編碼的產(chǎn)物為青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)，是細(xì)菌的一種耐抗菌藥物抑制作用的替代性靶位蛋白，它決定細(xì)菌對(duì)甲氧西林的耐藥性[4-5]。SA轉(zhuǎn)化為MRSA的基本原因是由于其基因組獲得了一種編碼PBP2a酶的mecA基因，意味著可產(chǎn)生正常的PBP，繼續(xù)合成肽聚糖，使細(xì)菌擁有結(jié)構(gòu)完好的細(xì)胞壁免受抗菌藥物的作用而產(chǎn)生耐藥性[6-9]。本研究中MRSA對(duì)青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率均為100.00%，同時(shí)40株MRSA的mecA基因均為陽(yáng)性，提示mecA基因大量表達(dá)是引起MRSA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因。另外PVL是一種殺白細(xì)胞的外毒素，攜帶PVL基因的SA毒力增強(qiáng)，破壞人體白細(xì)胞，使機(jī)體吞噬異物并產(chǎn)生抗體的作用減弱，機(jī)體對(duì)傷病的治愈能力下降[10-12]。本研究中PVL基因陽(yáng)性率為13.75%(11/80)，比曾云祥等[13]報(bào)道的7.4%要高，低于葉千紅等[14]報(bào)道的46.9%，與楊穎等[15]的17.1%較接近，可見PVL基因的陽(yáng)性率存在地區(qū)差異。在11例PVL基因陽(yáng)性菌株中，1例為血液感染，2例為肺部感染，其余8例均為皮膚或軟組織化膿性感染，與賴奮強(qiáng)等[16]報(bào)道的PVL基因可以顯著影響皮膚和肺部感染模型中的MRSA毒力結(jié)論一致，是臨床上引起皮膚或軟組織化膿性感染的常見致病菌[17]。

綜上所述，SA耐藥問(wèn)題日益突出，具有多種耐藥機(jī)制，由大量耐藥基因所編碼，以基因組學(xué)大數(shù)據(jù)為依托，深入解析了耐藥基因在細(xì)菌間的傳播網(wǎng)絡(luò)和規(guī)律，對(duì)深入認(rèn)識(shí)細(xì)菌耐藥性的進(jìn)化、細(xì)菌耐藥的形成機(jī)制等具有重要意義。本院耐藥基因mecA、PVL檢出率較高，可能是產(chǎn)生耐藥的重要原因，臨床上應(yīng)予以足夠重視。