基于IL-6/JAK2/STAT3信號通路研究巖白菜素對急性肝損傷大鼠的保護(hù)作用

藍(lán) 穎，張可鋒，連苑宇，陳俊杰，楊超越，王躍峰*，高 雅*

1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530021；2桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541000

急性肝損傷是一種在短期內(nèi)由于藥物中毒、免疫損傷、病毒感染等原因誘發(fā)的突發(fā)性肝功能異常疾病，目前治療肝損傷的方法很多，西藥療效明顯但藥物不良反應(yīng)較多且價(jià)格昂貴，肝移植治療方法也存在供源缺乏、并發(fā)癥多且病死率高等一系列問題[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥在預(yù)防和治療肝損傷中呈現(xiàn)獨(dú)特的療效，特別是中藥提取物和中藥單體化合物在抗氧化和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中作用顯著，能有效降低CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平和炎癥因子的釋放，提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的活性起到抗炎和抗氧化作用改善肝損傷，近年來也有茵梔黃注射液、水飛薊素片等中成藥開發(fā)上市來治療肝損傷且臨床療效顯著，但大多作用機(jī)制尚不明確[2-4]。巖白菜素是一種白色疏松針狀結(jié)晶或結(jié)晶粉末狀化合物，化學(xué)式C14H16O9，相對分子質(zhì)量328.27，易溶于甲醇微溶于水或乙醇，該化合物存在于虎耳草科巖白菜全草及厚葉巖白菜和紫金牛科百兩金的根莖葉中，是一種民間常用藥，分布于我國四川西南部、湖南、云南北部及西藏南部和東部，又名為巖虎耳草素、矮茶素、巖白菜內(nèi)脂、佛手配質(zhì)等[5]。其具有良好的生物活性：如抗炎、抗癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗心律不齊等，臨床上常用來治療慢性支氣管炎[6-9]。目前關(guān)于巖白菜素保肝的作用研究較少，因此，我們用CCl4誘導(dǎo)建立大鼠急性肝損傷模型，探究巖白菜素對急性肝損傷大鼠的保護(hù)作用，篩選新的保肝藥物，探究其治療急性肝損傷的作用機(jī)制來提高中藥防治的靶向性，為藥物的臨床應(yīng)用和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體重180 ～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0002，倫理委編號：GLMC201904008。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

巖白菜素(畢得醫(yī)藥，純度≥98.65%，批次：RMC804)；分析純CCl4(廣東汕頭市西隴化工廠)；水飛薊素(美倫生物技術(shù)有限公司，批號：M1120A)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)、磷酸化Janus蛋白酪氨酸激酶2(p-JAK2)、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-STAT3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白抗體(英國Abcam公司)；β-actin抗體購自傲銳東源生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所)；Super ECL Plus超敏發(fā)光液(北京普利萊基因科技有限公司)。

1.3 儀器

FRESCO 21高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司)；Olympus BX51顯微鏡(奧林巴斯)；Epoch 2HS酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器(太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Tek公司)；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析檢測系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Eppendorf移液器(Eppendorf股份公司)；AUW220D半微量電子天平(島津公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、水飛薊素(120 mg/kg)組、巖白菜素(20、40、80 mg/kg)低、中、高劑量組，每組10只。水飛薊素組，巖白菜素低中高劑量組大鼠每天以10 mL/kg灌胃給藥，正常組和模型組灌胃相應(yīng)體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)一周。末次給藥2 h后，除正常組以外，其余各組大鼠均腹腔注射25% CCl4橄欖油溶液2 mL/kg，建立急性肝損傷模型。禁食不禁水，16 h后眼球取血，并收集肝臟。

2.2 肝組織病理學(xué)檢測

使用4%多聚甲醛固定各組大鼠肝組織48 h，經(jīng)過梯度乙醇脫水，石蠟包埋，將蠟塊以4 μm厚度制作切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝組織的病理變化。

2.3 生化指標(biāo)檢測

將收集的血液在4 ℃靜置3 h，放置于離心機(jī)離心15 min(4 ℃，4 500 rpm)，收集血清置于-20 ℃中冰箱保存?zhèn)溆谩Ｉz測血清中ALT、AST、ALB、MDA、GSH-Px、SOD活性或含量。

2.4 ELISA檢測肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量

將肝組織置于研磨管中充分研磨，制備組織勻漿，取上清液后嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，檢測并計(jì)算肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量。

2.5 蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)

取肝組織約60 mg于研磨管，用移液槍吸取1 mL細(xì)胞裂解液加入研磨管后置于冰上充分研磨，待組織完全裂解后轉(zhuǎn)移至EP管中，離心(4 ℃，14 000 rpm，10 min)，取上清液，采用BCA法測定蛋白含量。先配制濃度為10%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，加入蛋白樣品后，調(diào)節(jié)電壓為80 V進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，在冰浴條件下300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉2 h后，用TBST漂洗3次，加入Ⅰ抗置于4 ℃孵育過夜；TBST漂洗3次后加入Ⅱ抗，4 ℃孵育2 h，采用ECL法顯色，全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯影，分析蛋白灰度并計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

2.6 免疫組化實(shí)驗(yàn)

將4 μm組織切片于烘箱中37 ℃烘片過夜，二甲苯脫蠟10 min，脫蠟后浸入梯度濃度乙醇中水化，使用抗原修復(fù)液枸櫞酸鈉高壓修復(fù)抗原4 min，修復(fù)后將切片冷卻至室溫，置于內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑10 min。PBS潤洗3次后滴加Ⅰ抗于組織切片，37 ℃孵育1 h，PBS潤洗3次后滴加Ⅱ抗孵育1 h，最后滴加DAB顯色液孵育3～5 min，進(jìn)行蘇木素染色、鹽酸酒精分化，流水反藍(lán)后梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察IL-6表達(dá)情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

觀察HE染色及免疫組化結(jié)果，正常組(圖1A)大鼠中央靜脈周圍未見細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤等病理變化，且肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈放射狀整齊排列。模型組(圖1B)大鼠可見肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，匯管區(qū)及中央靜脈周圍出現(xiàn)大量肝細(xì)胞變性且壞死和炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組相比，水飛薊素(圖1C)和巖白菜素組中(圖1E)、高(圖1F)劑量大鼠可見肝損傷程度明顯降低，肝組織病變明顯改善，巖白菜素高劑量組(圖1F)改善狀況尤為明顯，其肝小葉和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死情況改善。

3.2 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織IL-6表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，模型組(圖2B)黃棕色沉積物聚集增多，顯示IL-6表達(dá)明顯升高，主要在受損肝細(xì)胞周圍表達(dá)；與模型組相比，水飛薊素(圖2C)和巖白菜素組中(圖2E)、高(圖2F)劑量大鼠肝臟中IL-6表達(dá)明顯降低，結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 肝組織HE染色病理檢查圖(200×)Fig.1 HE staining pathological examination of liver tissue (200×)注：A：正常組；B：模型組；C：水飛薊素組；D：巖白菜素低劑量組；E：巖白菜素中劑量組；F：巖白菜素高劑量組；下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Silymarin group;D:Bergenin low dose group;E:Bergenin middle lose group;F:Bergenin high dose group;The same below.

圖2 肝組織IHC染色病理檢查圖(100×)Fig.2 IHC staining pathological examination of liver tissue (100×)

3.3 巖白菜素對大鼠血清中肝功能、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST、MDA水平顯著上升(P< 0.01)，ALB、SOD、GSH-Px含量或活性顯著降低(P< 0.01)。與模型組相比，水飛薊素組和巖白菜素中、高劑量組大鼠血清中ALT、AST、MDA水平顯著降低(P< 0.01)，ALB含量增加，SOD、GSH-Px活性顯著升高(P< 0.01)；巖白菜素低劑量組ALT、MDA水平降低(P< 0.05)，AST、ALB、SOD、GSH-Px活性或水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1、表2)。

表1 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠血清中ALT、AST和ALB的影響Table 1 Effects of bergenin on the activities of ALT,AST and ALB in serumof rats with acute liver injury induced by ± s,n = 10)

表2 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠血清中MDA、SOD和GSH-Px的影響Table 2 Effects of bergenin on the activities of MDA,SOD and GSH-Px in serum of ratswith acute liver injury induced by ± s,n = 10)

3.4 巖白菜素對大鼠肝組織中炎癥因子含量的影響

與正常組相比，模型組肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β的含量顯著升高(P< 0.01)。與模型組相比，水飛薊素組和巖白菜素中、高劑量組大鼠肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量顯著降低(P< 0.01)；巖白菜素低劑量組IL-6和IL-1β含量降低(P< 0.05)，TNF-α含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。

表3 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影響Table 3 Effects of bergenin on the contents of TNF-α,IL-6 and IL-1β in liver tissueof rats with acute liver injury induced by by ± s,n = 10)

3.5 巖白菜素對IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組大鼠肝組織中p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高(P< 0.01)。與模型組相比，水飛薊素組和巖白菜素中、高劑量組肝組織中p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低(P< 0.01)；巖白菜素低劑量組p-JAK2蛋白表達(dá)水平降低(P< 0.05)，p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

圖3 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織中p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of bergenin on p-JAK2,p-STAT3,p-NF-κB p65 protein expression in acute liver injury induced by CCl4

4 討論與結(jié)論

研究表明，JAK-STAT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過參與多種生長因子、細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)[17]。IL-6是一種調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的多功能細(xì)胞因子，IL-6/JAK2/STAT3信號通路的激活是IL-6與其靶細(xì)胞表面的受體sIL-6R識別結(jié)合形成復(fù)合物sIL-6R/IL-6，膜表面糖蛋白130(gp-130)被其活化后使得相關(guān)聯(lián)的JAK2被激活，激活后的JAK2與下游效應(yīng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)結(jié)合發(fā)生磷酸化[18,19]。磷酸化的STAT3激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，NF-κB被激活轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核后，繼而促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子釋放，這些炎癥因子表達(dá)過量時(shí)，又可正反饋?zhàn)饔糜贜F-κB，繼而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重肝組織的損傷[20-22]。此外，IL-6/JAK2/STAT3通路的激活可促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，并刺激IL-6的自分泌，從而形成正前饋循環(huán)，也會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大[23-25]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比模型組IL-6及p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65表達(dá)顯著增加，提示該炎癥信號通路可能被激活；給予巖白菜素藥物治療后，血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST、MDA、SOD、GSH-Px趨向正常，IL-6、p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65的表達(dá)不同程度降低，病理切片顯示肝組織匯管區(qū)及中央靜脈周圍肝細(xì)胞變性壞死和炎癥細(xì)胞浸潤狀況明顯改善，免疫組化明顯可見IL-6表達(dá)不同程度降低，以上提示巖白菜素可能通過干預(yù)IL-6的表達(dá)，從而抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路的激活減少炎癥因子的釋放，減少炎癥和凋亡，從而有效地改善肝損傷。

綜上所述，巖白菜素可有效減緩CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷，其機(jī)制可能與IL-6/JAK2/STAT信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和抗氧化有關(guān)，本研究結(jié)果可為臨床采用巖白菜素治療急性肝損傷提供新思路。