基于高分辨質譜法的淫羊藿特征藥效黃酮質譜裂解規律及新化合物鑒定研究

秦偉瀚，陽 勇，李 卿，劉 翔

重慶市中藥研究院，重慶 400065

淫羊藿始載于《神農本草經》，為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(EpimediumL.)植物的干燥葉[1]。其性溫，味辛、甘，歸肝、腎經[2]。具有補腎壯陽、強健筋骨、祛風除濕之功效；臨床多用于治療男性不育、骨質疏松等病癥[3-5]。淫羊藿物質基礎已經較為明確，主要藥效成分是以去甲淫羊藿素為母核的黃酮醇類衍生物，如研究報道較多的淫羊藿苷、朝藿定、淫羊藿次苷等均歸為此類[6-8]。筆者通過查閱相關文獻，發現該類化合物活性基團為C-3、C-7、C-4′位羥基以及C-8位的異戊烯基，通過甲基轉移反應、糖基轉移反應、氧化還原反應等形成了總共達54種結構活性類似的次生代謝產物[9,10]。迄今為止，對黃酮苷的質譜裂解研究已有大量報道，但沒有文獻將淫羊藿特征成分化學結構與質譜裂解規律相結合進行深入探討[11-15]。本實驗借助高分辨質譜法，將淫羊藿中特征藥效黃酮醇歸為苷元、單糖苷、二糖苷、三糖苷和四糖苷5類進行解析研究。該實驗結果有助于此類成分的定性定量分析以及新化合物的結構鑒定，為進一步明確淫羊藿的藥效物質基礎和生物合成規律提供科學依據。

1 儀器與材料

LC-30A型超高效液相色譜儀(日本，島津公司)；Triple TOFTM4600型四極桿串聯飛行時間高分辨質譜儀(美國，AB公司)；JY92-ⅡD型超聲波細胞粉碎機(中國，寧波新藝超聲設備有限公司)；HK-02A型高速中藥粉碎機(中國，廣州賽豪機械有限公司)；JM-20D-40型超聲波清洗機(中國，潔盟清洗設備有限公司)；AUW220型萬分之一分析天平(日本，島津公司)。

對照品淫羊藿苷(批號：489-32-7)、淫羊藿次苷I(批號：56725-99-6)、淫羊藿次苷II(批號：113558-15-9)、朝藿定A(批號：110623-72-8)、朝藿定B(批號：110623-73-9)、朝藿定C(批號：110642-44-9)、箭葉淫羊藿苷B(批號：118525-36-3)、2′′-鼠李糖淫羊藿次苷II(批號：135293-13-9)、寶藿苷II(批號：55395-07-8)、淫羊藿屬苷A(批號：39012-04-9)、去甲淫羊藿素(批號：28610-31-3)、脫水淫羊藿素(批號：116554-17-5)、茂藿苷A(批號：20872-01-4)、寶藿苷V(批號：118544-18-6)、粗毛淫羊藿苷(批號：143601-07-4)，質量分數均大于98%，均購于成都埃法生物科技有限公司；乙腈(色譜級，德國Merck公司)、甲酸(色譜級，美國ACS公司)，其余試劑為分析純；水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。不同品種淫羊藿樣品均采自于重慶、四川、貴州、湖南等地，經重慶市中藥研究院生藥研究所劉翔副研究員鑒定為小檗科多年生草本植物淫羊藿的地上部分。54批樣品信息見表1。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫30 ℃；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，體積流量0.2 mL/min；梯度洗脫：0～1.0 min，7%乙腈；1.0～7.0 min，7%→55%乙腈；7.0～11.5 min，55%→88%乙腈；11.5～13.0 min，88%乙腈；13.0～13.1 min，88%→7%乙腈；13.1～15.0 min，7%乙腈；進樣量2 μL。

2.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式采集數據，噴霧電壓(IS)：+5 500 V；霧化氣壓力(GS1)：0.40 MPa；氣簾氣壓力(CUR)：0.12 MPa；輔助氣壓力(GS2)：0.35 MPa；離子源溫度(TEMP)：550 ℃；簇裂解電壓(DP)：50 V；碰撞能量(CE)：40 eV；碰撞能量區間(CES)：15 eV；檢測模式為IDA(信息關聯采集模式)，多重質量虧損(MMDF)和動態背景扣除(DBS)為觸發二級的條件，滿足該條件優先進行二級掃描。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取淫羊藿樣品粉末0.1 g，置5 mL EP管中，精密加入70%的甲醇水溶液2 mL，浸潤1 h后稱定重量，超聲波細胞破碎處理(功率：800 W)25 min，放冷，再次稱定重量，用70%甲醇溶液補足減失重量，混勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過于進樣瓶中，即得。

2.4 樣品數據分析處理

根據淫羊藿化學相關文獻，構建以去甲淫羊藿素為母核的已知化學成分數據庫。應用PeakView軟件提取分析高分辨質譜采集的不同品種批次樣品數據，將滿足質量誤差小于5 ppm、同位素分布正確且含有二級碎片的離子作為目標化合物，結合軟件Formula Finder、Mass Calculators等功能、在線數據庫(SciFinder、Reaxys、ChemSpider、Metlin、HMDB)，進行快速的定性分析。將鑒定結果按照苷元、單糖苷、二糖苷、三糖苷、四糖苷進行歸類，探討總結該類化合物的二級質譜裂解規律，并憑借此規律進行新化合物的結構判定。

3 結果與分析

淫羊藿的特征藥效黃酮是一類以去甲淫羊藿素為母核的黃酮醇衍生物，該類化合物母核的C-3、C-7位羥基、C-8位異戊烯基和C-4′位甲氧基是其活性基團，通過甲基轉移反應、糖基轉移反應、氧化還原反應等形成了各種活性結構類似的次生代謝產物(見圖1)。據統計該類化合物共有54種，本研究采用超高效液相-高分辨質譜法在54批15個淫羊藿品種中共鑒定出了27種該類成分，其中兩個被鑒定為淫羊藿的新化合物，鑒定結果見表2。樣品(S6)的總離子流圖見圖2。

圖1 淫羊藿特征黃酮醇成分次生代謝途徑Fig.1 Secondary metabolic pathways of alcohol components in characteristic flavonoids of Herba Epimedii

表2 淫羊藿特征黃酮成分鑒定結果Table 2 Identification of characteristic flavonoids from Herba Epimedii

圖2 樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion current diagram of the sample

3.1 質譜裂解規律解析

3.1.1 苷元成分裂解規律解析

統計淫羊藿化學相關文獻資料，該植物中特征黃酮醇的苷元成分共有5個，分別為去甲淫羊藿素、去甲淫羊藿苷、去甲淫羊藿黃素、脫水淫羊藿素、異去氫淫羊藿素和anhydrocicaritin。除了去甲淫羊藿苷、去甲淫羊藿黃素未被檢測出以外，其它幾個苷元均有質譜響應。由圖2可知，去甲淫羊藿素、脫水淫羊藿素、異去氫淫羊藿素結構類似，差別僅在于O-甲基化位置不同，通過比較這幾個化合物的二級譜圖，可以發現C-8位異戊烯基最容易斷裂，其次是甲氧基和母核C環。Anhydrocicaritin的化學結構與其它幾個苷元的差異主要是C-8位異戊烯基與C-7位羥基成環，由該化合物二級質譜可知(見圖2D)，環斷裂后可以連續脫去烴基生成m/z311和m/z299的離子，這種碎裂方式與其它幾個苷元完全不同，且其它幾個苷元均是先脫異戊烯基再脫甲氧基或甲基，而anhydrocicaritin則是先脫甲氧基再斷裂環狀結構，這種質譜行為差異可能與C-8、C-7位基團成環后的化學結構更加穩定有關。

3.1.2 單糖苷成分裂解規律解析

淫羊藿植物中含異戊烯基黃酮醇的單糖苷成分共報道有12個，本研究鑒定出了7個。由圖3可知，這7個單糖苷化合物含有C-3位的鼠李糖苷或C-7位的葡萄糖苷，通過比較二級譜圖可以發現單糖苷的碎裂規律為C-3、C-7位的糖苷鍵首先斷裂，之后即是脫掉C-8位異戊烯基和C-4′位的甲氧基。但茂藿苷A(見圖3G)、淫羊藿素-3-O-α-鼠李糖苷(見圖3F)的C-8位異戊烯基雙鍵被水加成還原，形成一個帶有羥基的結構，在質譜碎裂中表現為糖苷鍵斷裂后C-8位異戊醇基脫水后再脫烴基。粗毛淫羊藿苷(見圖3C)的C-8、C-7位成環之后再脫氫形成雙鍵并與母核A環的雙鍵共軛，因此該環狀結構比異戊烯基更加穩定，所以粗毛淫羊藿苷在C-3位鼠李糖苷脫掉后，C-4′位再脫掉一個甲基，且二級質譜中沒有發現異戊烯基斷裂產生的離子碎片。

圖3 苷元化合物的質譜裂解規律圖Fig.3 Fragmentation patterns of aglycones by mass spectrometry注：A：去甲淫羊藿素；B：脫水淫羊藿素；C：異去氫淫羊藿素；D：Anhydrocicaritin。Note:A:Desmethylicaritin;B:Anhydroicaritin;C:Isoanhydroicaritin;D:Anhydrocicaritin.

3.1.3 二糖苷成分裂解規律解析

淫羊藿植物中含異戊烯基黃酮醇的二糖苷成分共報道有17個，本研究鑒定出了7個。由圖4可知，鑒定出的二糖苷化合物均在C-3和C-7位鍵合有葡萄糖苷、鼠李糖苷和木糖苷，C-8位鍵合有一個異戊烯基，C-4′位或有一個甲氧基。通過比較二糖苷化合物的化學結構，可以發現C-3位羥基只與鼠李糖苷直接相連，C-7位羥基只與葡萄糖苷直接相連，且C-3、C-7位均有同時鍵合兩個糖苷的情況(大花淫羊藿苷F、粗藿苷、箭葉淫羊藿苷B、2′′-鼠李糖基淫羊藿次苷II)。通過比較上述化合物的二級質譜，發現二糖苷化合物的裂解規律為C-3位的糖苷鍵首先會由外至內的進行斷裂，其次是斷掉C-7位的糖苷鍵，之后則是脫掉C-8位的異戊烯基和C-4′位的甲氧基。造成此質譜行為的原因可能與該類化合物的構象及化學鍵的鍵能等因素相關。

圖4 單糖苷化合物質譜裂解規律圖Fig.4 Fragmentation patterns of monosaccharide compounds by mass spectrometry注：A：寶藿苷II；B：淫羊藿屬苷C；C：粗毛淫羊藿苷；D：淫羊藿次苷II；E：淫羊藿次苷I；F：淫羊藿素-3-O-α-鼠李糖苷；G：茂藿苷A。Note:A:Baohuoside II;B:Epimedoside C;C:Acuminatin;D:Icariside II;E:Icariside I;F:Icaritin-3-O-α-rhamnoside;G:Maohuoside A.

3.1.4 三糖苷成分裂解規律解析

淫羊藿植物中含異戊烯基黃酮醇的三糖苷成分共報道有17個，本研究鑒定出了6個。由圖5可知，鑒定出的三糖苷化合物均在C-3和C-7位鍵合有葡萄糖苷、鼠李糖苷和木糖苷，C-8位鍵合有一個異戊烯基，C-4′位或有一個甲氧基。通過比較三糖苷化合物的化學結構，可以發現與二糖苷相同的是C-3位羥基只與鼠李糖苷直接相連，C-7位羥基只與葡萄糖苷直接相連，但C-7位沒有同時鍵合兩個糖苷的情況。對比三糖苷化合物的二級質譜，發現三糖苷化合物的裂解規律與二糖苷一致，均為C-3位的糖苷鍵首先會由外至內的進行斷裂，其次是斷掉C-7位的糖苷鍵，之后則是脫掉C-8位的異戊烯基和C-4′位的甲氧基。但朝藿定I與其它三糖苷化合物結構上略有不同(見圖5F)，有一分子的乙酰基連接在了鼠李糖苷上，結合二級質譜分析發現，該化合物在脫掉C-3位葡萄糖苷之后會先脫掉乙酰基再脫掉鼠李糖苷。這也提示含有乙酰基的該類成分，在質譜行為中其酯鍵會先于所連糖苷的糖苷鍵發生斷裂。

圖5 二糖苷化合物質譜裂解規律圖Fig.5 Fragmentation patterns of diglycoside compounds by mass spectrometry注：A：大花淫羊藿苷F；B：箭葉淫羊藿苷B；C：淫羊藿屬苷A；D：Hexandraside E；E：2′′-鼠李糖基淫羊藿次苷II；F：淫羊藿苷；G：粗藿苷。Note:A:Ikarisoside F;B:Sagittatoside B;C:Epimedoside A;D:Hexandraside E;E:2′′-O-Rhamnosylicariside II;F:Icariin;G:Cuhuoside.

3.1.5 四糖苷成分裂解規律解析

淫羊藿植物中含異戊烯基黃酮醇的四糖苷成分僅報道2個(二葉淫羊藿苷C、粗毛淫羊藿苷)。本研究鑒定出了粗毛淫羊藿苷，由圖6可知，粗毛淫羊藿苷的C-3位鍵合了2個鼠李糖苷，C-7位鍵合了2個葡萄糖苷，C-8位有一個異戊烯基，C-4′位有一個甲氧基。通過分析該化合物的二級質譜，推測四糖苷化合物的裂解規律為C-3位的糖苷鍵首先會由外至內的進行斷裂，其次是C-7位的糖苷鍵由外至內的進行斷裂，之后則是脫掉C-8位的異戊烯基。比較三糖苷與四糖苷化合物的結構可以發現，這兩類成分的結構差異主要為C-7位多了1個糖苷，所以質譜裂解規律相似，至于四糖苷化合物較少的原因可能與該代謝途徑的生物合成積累相關。

圖6 三糖苷化合物質譜裂解規律圖Fig.6 Mass spectroscopic fragmentation of triglycoside compounds注：A：寶藿苷V；B：朝藿定B；C：柔藿苷；D：朝藿定C；E：朝藿定A；F：朝藿定I。Note:A:Baohuoside V;B:Epimedin B;C:Rouhuoside;D:Epimedin C;E:Epimedin A;F:Epimedin I.

3.2 基于質譜裂解規律的新化合物可能結構鑒定

3.2.1 新化合物M1的可能結構鑒定

保留時間為7.92 min的化合物M1，分子式為C35H42O16，[M+H]+的實際測量值為719.255 5，理論值為719.254 5，誤差為1.4 ppm，由質譜二級碎片圖(見圖7)可知m/z為719.261 6的母離子連續脫去188.069 5、162.055 5、56.063 1 Da生成m/z531.192 1、m/z369.136 6、m/z313.073 5的碎片離子。再由m/z為189.078 0的離子連續脫去18.011 1、42.011 0、18.010 8 Da生成m/z171.066 9、m/z129.055 9、m/z111.045 1的碎片離子。通過PeakView軟件的Mass Calculators功能計算出C8H12O5、C6H10O5、C4H8、H2O、C2H2O的精確質量數分別為188.067 93、162.052 28、56.062 05、18.010 02、42.010 02 Da，與上述脫去碎片差值均小于0.01 Da，表明該化合物可能存在鼠李糖苷、乙酰基、葡萄糖苷、異戊烯基、羥基的結構。

參考淫羊藿化學相關文獻，化合物M1僅與朝鮮淫羊藿屬苷Ⅱ、箭葉淫羊藿苷C為同分異構體。由圖8可知，此兩化合物的葡萄糖苷均鍵合在C-3位的鼠李糖苷上，根據該類化合物質譜裂解規律，C-3位上的糖苷鍵會由外向內依次斷掉。由此推測朝鮮淫羊藿屬苷Ⅱ、箭葉淫羊藿苷C會先脫掉葡萄糖苷，即先脫掉162的碎片。而M1則是先脫掉1個含乙酰基的鼠李糖苷，再脫掉1個葡萄糖苷，表明該化合物的葡萄糖苷沒有鍵合在C-3位上，而是鍵合在C-7位的羥基上。由二級譜圖(見圖7B)可知M1含有m/z189的離子碎片，經過軟件計算，該碎片是由一分子鼠李糖和一分子乙酰基組成，同時也證明乙酰基是連在C-3位的鼠李糖苷之上。將該化合物結構信息代入SciFinder、Reaxys等在線數據庫進行檢索，未匹配到與M1相一致的化學結構，故推測其為淫羊藿的新化合物。

圖7 四糖苷化合物粗毛淫羊藿苷質譜裂解規律圖Fig.7 Mass spectroscopic analysis of acuminatoside from tetraglycoside

圖8 新化合物M1的提取離子圖和二級裂解規律圖Fig.8 Extraction ion diagram and secondary cracking diagram of a new compound M1注：A：提取離子圖；B：二級裂解規律圖。Note:A:Extracted ion map;B:Secondary cracking pattern.

3.2.2 新化合物M2的可能結構鑒定

保留時間為7.21 min的化合物M2，分子式為C45H60O24，[M+H]+的實際測量值為985.351 3，理論值為985.354 7，誤差為3.4 ppm，由質譜二級碎片圖(見圖9)可知m/z為985.369 8的母離子連續脫去162.057 7、146.059 1、146.060 2、162.055 3、56.063 3 Da生成m/z823.312 1、m/z677.253 0、m/z531.192 8、m/z369.137 5、m/z313.074 2的碎片離子。通過PeakView軟件的Mass Calculators功能計算出C6H10O5、C6H10O4、C4H8的精確質量數分別為162.052 28、146.057 36、56.062 05 Da，與上述脫去碎片差值均小于0.01 Da，表明該化合物可能存在葡萄糖苷、鼠李糖苷和乙酰基的結構。

圖9 新化合物M1與同分異構體成分的結構比較圖Fig.9 Structural comparison of new compound M1 with its isomer

參考淫羊藿化學相關文獻，化合物M2僅與粗毛淫羊藿苷為同分異構體。由圖10可知，粗毛淫羊藿苷的C-3位上鍵合兩個鼠李糖苷，C-7位上鍵合兩個葡萄糖苷。根據該類化合物質譜裂解規律，C-3位的糖苷鍵會由外向內依次斷掉，之后即是C-7位的糖苷鍵由外向內依次斷掉。由此推測粗毛淫羊藿苷會連續脫掉146、146、162、162的離子碎片，這也與該化合物的二級碎片檢測結果一致(見圖6)，但M2的二級質譜則是連續脫掉162、146、146、162的碎片。由該類化合物結構可知，C-3位和C-7位鍵合的糖苷數目沒有超過2個，且C-3位只與鼠李糖苷直接相連，C-7位只與葡萄糖苷直接相連(見圖11)。據此推測M2的結構中C-3位和C-7位均有一個葡萄糖苷和鼠李糖苷相連。將該化合物結構信息代入SciFinder、Reaxys等在線數據庫進行檢索，未匹配到與M2相一致的化學結構，故推測其為淫羊藿的新化合物。

圖10 新化合物M2的提取離子圖和二級裂解規律圖Fig.10 Extraction ion diagram and secondary fragmentation diagram of a new compound M2注：A：提取離子圖；B：二級裂解規律圖。Note:A:Extracted ion map;B:Secondary cracking pattern.

圖11 新化合物M2與同分異構體成分結構比較圖Fig.11 Comparison of composition and structure between new compound M2 and isomer

4 討論

淫羊藿是我國常用且重要的補益類中藥材，雖然對淫羊藿的藥效物質基礎報道較多，但迄今沒有文獻對該類成分的化學結構以及質譜裂解規律進行過分析總結，不利于該類成分的定性定量分析、生物合成規律探討以及新成分新化合物的鑒定。本研究借助高分辨質譜，通過實驗對含有異戊烯基藥效黃酮醇的二級質譜解析發現，該類化合物在含有ESI源質譜中首先會由外至內的斷裂C-3位糖苷鍵及乙酰基，之后則是由外至內的斷裂C-7位糖苷鍵及乙酰基，其后則是脫去C-8位的異戊烯基和C-4′位的甲氧基，如果C-8位異戊烯基雙鍵被水加成還原為了異戊醇基，那么其質譜碎裂行為會先脫水再脫掉烴基，如果C-8位與C-7位基團成環，將不會產生異戊烯基的特征碎片。并借由上述裂解規律鑒定出了2個新化合物的化學結構，但高分辨質譜對同分異構體的結構鑒定能力存在一定缺陷，新化合物的化學結構還得依靠植化分離后，通過核磁共振波譜進行最終確定。據文獻報道，淫羊藿植物中含異戊烯基黃酮醇成分的C-3位羥基是重要活性位點[10]，表明C-3位羥基糖苷化更易發生反應，與之相應的是在質譜行為中該位點的糖苷鍵也更容易斷裂。糖苷鍵在質譜碎裂中屬于異裂，即斷裂時電荷不平均分配，所以該類衍生物中糖苷鍵的偶極矩大小或許是決定其斷裂難易程度的一個重要的因素，這還有待課題組做進一步研究驗證。本實驗結果為深入闡明淫羊藿的藥效物質基礎及生物合成規律提供了科學依據。