不同劑量解鉀菌對滇重樓生長發育的影響

周 濃，許凌峰，楊 敏，郭冬琴，丁 博，朱芙蓉，趙晶晶*

1重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404000；2大理大學藥學與化學學院，大理 671000

滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)具有消腫止痛、清熱解毒、涼肝定驚等功效備受各界人士的關注，我國西南地區作為栽培滇重樓的主產區之一，其人工栽培已成為當地獨具特色的生物資源和經濟支柱產業[1]，由于制藥工業的需求量逐年增長，野生滇重樓資源逐年減少且日趨瀕臨枯竭，為了緩解市場的供需矛盾，滇重樓種植面積逐年增加，為了避免栽培滇重樓出現病蟲害嚴重、產量降低和品質退化等現象，維持滇重樓種植區的可持續發展，種植戶通過多種農業生物技術途徑來提高滇重樓產量和品質[2]。

鉀是植物生長必需的營養元素之一，對植物體內的能量代謝和物質代謝具有重要的影響，土壤中能被植物利用的有效鉀為鉀素總量的2%，提高土壤中鉀的有效性是提高植物產量的有效途徑之一。土壤中鉀素多以固定鉀和礦物鉀的形式存在而不能被植物根系直接吸收，這成為了制約植物生長所需鉀營養的一大阻礙。解鉀菌亦稱為鉀細菌是植物根際促生菌中常見的一類，可將土壤中礦化鉀轉化分解成可溶性鉀物質，改善根際土壤微生態環境，提高土壤中速效鉀含量，從而促進植物的生長、產量的提高以及品質的改善[3,4]，增強植株的抗病力等[5]，這是因為植物根際的解鉀菌能產生對土壤微生物活性有促生作用的分泌物[6,7]。前人關于解鉀菌對烤煙生長發育的調控結果表明[8,9]，適量增施解鉀菌能有效地增加烤煙的株高、莖圍、有效葉片數、最大葉長、最大葉寬等農藝性狀，使植株葉片內的總氮和鉀含量有不同程度地升高[10]，顯著提高了烤煙的產量和經濟價值，改善了其品質。因此，解鉀菌可作為微生物肥料，促進植物生長，提高植物鉀素吸收，降低化肥使用量，促進農業可持續發展。

目前為止，解鉀菌對土壤內礦化鉀的分解作用已經逐漸引起了學者的重視，利用植物與解鉀菌的相互作用來調節植物根際鉀的有效性，將礦化鉀轉化為速效鉀已成為當前的研究熱點，但有關解鉀菌對植物的促生效應研究多以馬鈴薯[3]和烤煙[8-10]等喜鉀作物為主，而有關解鉀菌對藥用植物生長發育的影響研究尚不多見，關于解鉀菌對滇重樓藥材生長發育狀況鮮見報道。本研究以滇重樓幼苗為指示植物，解鉀菌施用量作為試驗對象，研究不同劑量的鉀細菌對滇重樓幼苗生長發育及藥用品質的影響，尋找出滇重樓最適解鉀菌接種量，為解鉀菌在滇重樓栽培生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試滇重樓種苗選自云南省大理州農科院滇重樓種植基地8～10年生大小基本一致的樣品，經三峽庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室(重慶三峽學院)郭冬琴副教授鑒定為百合科植物滇重樓Parispolyphyllavar.yunnanensis的新鮮根莖。解鉀菌購自廣州市微元生物科技有限公司，其有效活菌數≥2×1010CFU/g。

1.2 實驗設計

本試驗采用室溫盆栽法進行研究，供試土壤取自重慶三峽學院百安校區菜園的黃壤土，與干凈河砂按3∶1(V∶V)進行混合作為栽培基質，121 ℃高壓滅菌鍋內滅菌2 h，黑暗條件下保存1周后裝盆，每盆裝土量為16.0 kg。溫室光照時間為14 h，光照強度設置為280 μmol/(m2·s)，土壤含水量維持在田間持水量的70%～80%范圍內。同年6月(T1期)、7月(T2期)和8月(T3期)采用灌根方式接種解鉀菌，試驗設不接種解鉀菌作為對照(CK)和接菌處理，接種解鉀菌劑量依次為5.83 g(K1)、17.50 g(K2)和35.00 g(K3)，每盆為一個試驗單元，采用隨機區組進行排列，每個處理設10次重復，每重復1盆，栽種大小基本一致的滇重樓5株，將剩余平衡土1 750.00 g加入盆中覆蓋幼苗，生長期按常規管理。

1.3 測定項目及方法

于同年12月采取滇重樓的根系作為待測樣品，根據Li[11]的方法測定根系活力。采取滇重樓的葉片作為待測樣品，根據Lichtenthaler[12]的方法測定葉片葉綠素(chlorophyll，Chl)和類胡蘿卜素(carotenoids，Car)含量；根據Dhindsa等[13]方法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)和可溶性糖含量；根據Bradford[14]的方法測定可溶性蛋白含量；根據Fu和Huang[15]的方法測定過氧化氫酶(catalase，CAT)活性；根據Giannopolitis等[16]的方法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；根據Choudhary[17]的方法測定過氧化物酶(peroxidase，POD)活性。采取滇重樓的老根莖和新根莖作為待測樣品，清水洗凈后45 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩，采用原子吸收光譜法測定解鉀菌處理下滇重樓老根莖和新根莖內鉀(K)、錳(Mn)、鎂(Mg)、鋅(Zn)、鉛(Pb)、銅(Cu)、砷(As)和鎘(Cd)的含量[18]，Pb、Cu和Cd空心陰極燈購買自北京曙光明電子光源儀器有限公司，Pb(批號100808)、Cu(批號100609)、Cd(批號103110)標準貯備液購自國家環境保護總局標準樣品研究所，其他試劑均為優級純，水為去離子水。

1.4 數據處理

試驗數據的整理分析采用Excel 2003軟件；SPSS 22.0軟件進行兩因素方差分析，并用鄧墾法比較數據間的差異，差異顯著水平為0.05；繪圖采用Origin 9.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 不同劑量解鉀菌對滇重樓根系活力的影響

根系作為植物吸收養分的主要器官，其根系活力強弱可以直接反映植物根系吸收養分的能力。由圖1分析可知，不同時期接種不同劑量的解鉀菌均可顯著提高滇重樓根系活力，T1期和T3期隨著解鉀菌劑量的增加，其根系活力逐漸升高，其中K3處理的調控效果最好，分別比CK依次提高了30.99%和440.53%(P<0.05)；T2期接種K2的調控效果最佳，與CK相比，根系活力升高了106.16%(P<0.05)。總而言之，于滇重樓苗期接種35.00 g(K3)解鉀菌對根系活力的調控效果最好，而接種17.50 g(K2)解鉀菌的調控效果次之。

2.2 不同劑量解鉀菌對滇重樓葉片生理特性的影響

2.2.1 不同劑量解鉀菌對滇重樓葉片光合色素含量的影響

Chl和Car作為植物光合作用的主要色素，其含量變化與植物的生長發育和生存密切相關。試驗結果表明(見圖2)，于滇重樓不同時期接種不同劑量的解鉀菌均可促進葉片內Chl和Car含量的增加，其中，Chl a含量的增長幅度依次為6.62%～43.11%、13.07%～26.13%和6.33%～44.33%，Chl b含量的增長幅度依次為6.82%～59.98%、16.61%～21.32%和12.20%～69.39%，Chl a+b含量的增長幅度依次為6.66%～46.37%、13.10%～25.17%和7.33%～48.61%，Car含量的增長幅度依次為9.97%～44.59%、14.09%～26.57%和6.96%～36.65%，經方差分析可知，處理與CK間差異均達顯著水平(P<0.05)。總體而言，于滇重樓幼苗期接種35.00 g(K3)解鉀菌對葉片光合色素含量的調控效果最好。

2.2.2 不同劑量解鉀菌對滇重樓葉片丙二醛含量的影響

由圖3分析可知，不同時期接種不同劑量的解鉀菌可顯著降低滇重樓葉片內MDA含量，其中，與CK相比，T2期各處理葉片內MDA含量依次減少了13.63%、19.52%和29.21%，T3期各處理葉片內MDA含量依次減少了54.49%、60.77%和83.40%，方差分析可知，處理與CK間差異顯著(P<0.05)。T1期接種解鉀菌雖然顯著降低了葉片內MDA含量，但是不存在劑量效應。總而言之，于滇重樓苗期接種35.00 g(K3)解鉀菌對葉片內MDA含量的抑制效果最佳，而接種17.50 g(K2)解鉀菌的抑制效果次之。

圖3 不同劑量解鉀菌對滇重樓丙二醛含量的影響Fig.3 The effect of different dosages potassium-dissolving bacteria on MDA content in P.polyphylla var.yunnanensis

2.2.3 不同劑量解鉀菌對滇重樓葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

不同時期接種不同劑量的解鉀菌對滇重樓葉片內可溶性蛋白和可溶性糖含量的調控效果如表1所示，隨著接種時期的延長，葉片內可溶性蛋白質含量的增長幅度依次為6.40%～13.80%、5.94%～17.46%和9.06%～21.86%，可溶性糖含量的增長幅度依次為0.94%～30.18%、5.38%～9.19%和21.40%～32.23%，方差分析可知，除T1期K3處理外，其余處理與CK之間差異均達顯著水平(P<0.05)。

表1 不同劑量解鉀菌對滇重樓可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Table 1 The effect of different dosages potassium-dissolving bacteria on solubleprotein and soluble sugar content in P.polyphylla var.yunnanensis

2.2.4 不同劑量解鉀菌對滇重樓葉片保護酶活性的影響

由表2分析可知，不同時期接種不同劑量的解鉀菌導致葉片內抗氧化酶活性(CAT、SOD和POD)不同程度地降低，其中，T1期上述抗氧化酶活性下降幅度依次為9.46%～63.63%、30.39%～51.78%和1.71%～61.90%，方差分析可知，除K1處理的滇重樓葉片內POD酶活性與CK間差異不顯著外，其余處理與CK之間差異均達顯著水平(P<0.05)。T2期上述抗氧化酶活性下降幅度依次為2.79%～11.19%、17.22%～58.63%和3.52%～28.65%，方差分析可知，除K1處理的滇重樓葉片內CAT酶活性以及K3處理的滇重樓葉片內POD酶活性與CK間差異不顯著外，其余處理與CK之間差異均達顯著水平(P<0.05)。T3期上述抗氧化酶活性下降幅度依次為5.75%～49.72%、57.53%～83.79%和12.46%～24.03%，方差分析可知，處理與CK間差異顯著(P<0.05)。總體而言，各時期接種35.00 g(K3)解鉀菌對抗氧化酶活性的調控效果最佳，而接種17.50 g(K2)解鉀菌的調控效果次之。

表2 不同劑量解鉀菌對滇重樓保護酶活性的影響Table 2 The effect of different dosages potassium-dissolving bacteria on protect enzyme activities in P.polyphylla var.yunnanensis

2.3 不同劑量解鉀菌對滇重樓根莖內元素含量的影響

2.3.1 不同劑量解鉀菌對滇重樓根莖內鉀含量的影響

從圖4的結果來看，不同時期接種不同劑量的解鉀菌均可增加滇重樓老根莖和新根莖內的鉀含量，其中，各時期接種35.00 g(K3)解鉀菌的調控效果最顯著，與CK相比，隨著接種時期的延長，老根莖的增長率依次為167.54%、47.30%和73.83%，新根莖的增長率依次為157.78%、72.30%和20.42%，方差分析可知，處理與CK間差異均達顯著水平(P<0.05)。

圖4 不同劑量解鉀菌對滇重樓根莖內鉀元素含量的影響Fig.4 The effect of different dosages potassium-dissolving bacteria on potassium content in rhizome of P.polyphylla var.yunnanensis注：A代表老根莖；B代表新根莖。Note: A represents the old rhizome;B represents the new rhizome.

2.3.2 不同劑量解鉀菌對滇重樓根莖內營養元素含量的影響

由表3可知，不同時期接種不同劑量的解鉀菌對滇重樓老根莖和新根莖內Mn、Mg和Zn含量均起到促進作用。總體來看，解鉀菌對新根莖內營養元素含量的調控效果好于老根莖；隨著接種解鉀菌劑量的增加，老根莖和新根莖內上述營養元素含量的增長幅度逐漸升高，這說明各時期接種35.00 g(K3)解鉀菌對根莖內營養元素含量的調控效果最佳，其中，滇重樓老根莖內Mn含量最高可達到0.57 g/kg(T1-K3處理)、Mg含量最高可達到20.08 g/kg(T1-K3處理)、Zn含量最高可達到0.43 g/kg(T2-K3處理)，新根莖內Mn含量最高可達到0.19 g/kg(T1-K3和T2-K3處理)、Mg含量最高可達到22.86 g/kg(T1-K3處理)、Zn含量最高可達到0.76 g/kg(T1-K3處理)，接種17.50 g(K2)解鉀菌的調控效果次之。

2.3.3 不同劑量解鉀菌對滇重樓根莖內重金屬含量的影響

由表4分析可知，不同時期接種不同劑量解鉀菌可顯著降低滇重樓老根莖和新根莖內的重金屬(Pb、Cu、As和Cd)含量，對于老根莖而言，T1期上述重金屬含量依次降低了58.40%～72.59%、25.59%～37.16%、22.69%～44.11%和10.44%～19.69%，T2期上述重金屬含量依次降低了21.91%～39.80%、63.78%～86.02%、24.29%～35.72%和6.87%～22.49%，T3期上述重金屬含量依次降低了64.37%～76.31%、53.18%～78.86%、13.84%～26.09%和4.19%～63.26%，方差分析可知，除T3期K1處理Cd含量外，其余處理與CK間差異均達顯著水平(P<0.05)。對于新根莖而言，T1期上述重金屬含量依次降低了22.23%～64.17%、61.70%～87.23%、21.34%～51.72%和15.53%～42.17%，T2期上述重金屬含量依次降低了29.02%～63.75%、26.98%～68.93%、24.57%～38.79%和46.56%～62.94%，T3期上述重金屬含量依次降低了67.97%～82.95%、76.43%～99.52%、6.48%～14.47%和8.37%～25.03%，總體而言，解鉀菌對滇重樓新根莖內重金屬含量的調控效果好于老根莖。

表4 不同劑量解鉀菌對滇重樓重金屬含量的影響Table 4 The effect of different dosages potassium-dissolving bacteria on heavy metal content in P.polyphylla var.yunnanensis

3 討論

3.1 解鉀菌對植物生理特性的影響

大量施用化肥雖然提高了作物產量，但也帶來了諸多問題，如生態環境惡化、化肥利用率降低、土壤微生物區系單一化等。而解鉀菌作為植物根際促生細菌，不僅對植物生長發育起到促進作用，并且還能夠起到生物防治的作用，含有解鉀菌的生物菌肥具有固氮、解鉀及分泌植物激素等生理活性[9]，在一定程度上可替代化肥、農藥等用于農業生產中[19]。本研究結果表明，滇重樓苗期接種解鉀菌使其根系活力增強，促進了滇重樓根系對土壤中營養物質的吸收和運輸功能，這有利于滇重樓的整體生長，與Li等[10]在烤煙和Shi等[20]在棉花上的調節效果相同。解鉀菌對滇重樓根系活力的調控效果存在劑量效應，于滇重樓苗期接種35.00 g(K3)解鉀菌對根系活力的調控效果最好，而接種17.50 g(K2)解鉀菌的調控效果次之。

Chl和Car作為葉綠體類囊體內的光合色素是植物進行光合作用的主要場所，其含量高低直接影響植物光合作用情況。前人研究發現[10,21]，在一定的施肥量或土壤肥力條件下，當解鉀菌作為生物肥施用可以促進植物葉片內光合色素的合成，延緩光合色素的降解，進而提高葉片的光合色素含量，本研究結果也說明了這個問題。相似的研究結果在烤煙[10]、核桃[21]等植物中也均得到了證實。

MDA含量的變化情況可以衡量植物細胞脂質過氧化程度，當植物體內MDA含量被抑制時，說明此時植物的細胞膜系統比較穩定，這有利于提高植物葉片內細胞的生理活性。植物生長發育過程中，葉片內滲透調節物質(可溶性蛋白和可溶性糖)含量的增加有利于細胞代謝速度的加快，而葉片內保護酶活性降低說明植物體內的活性氧積累量被抑制，這可以減輕不利環境因素造成的氧化傷害[22]，進而促進植物的生長發育，在宿主的生理代謝上通過滲透調節和抗氧化防御系統來提高植物的抗逆性[23]，可培育具有較強生理活性和較好抗逆性的健壯幼苗。本研究結果表明，滇重樓苗期接種不同劑量的解鉀菌可使其葉片內的MDA含量減少，可溶性蛋白和可溶性糖含量增加，而CAT、SOD和POD活性降低，這說明外源接種解鉀菌維持了滇重樓葉片內細胞膜系統的穩定，加快了細胞代謝速度，避免了不利環境因素對植株造成的氧化損傷，進而促進滇重樓植株的生長發育，這與棉花種子萌發[24]和核桃一年生容器苗[21]中的觀察結果相一致。不同時期接種不同劑量的解鉀菌對滇重樓葉片生理特性的調控效果不同，其中，于滇重樓苗期接種35.00 g(K3)解鉀菌對葉片生理特性的調控效果最好，而接種17.50 g(K2)解鉀菌的調控效果次之。

3.2 解鉀菌對植物體內元素含量的影響

鉀作為植物生長中需求量較大的礦質元素，是植物生長所需養分的有效來源，在植物體內以離子態或可溶態鉀鹽形態存在而被重復利用，對植物體內的許多酶具有“激活”作用，植物體內鉀含量的增加不僅可以提高植物光合速率和酶的活化速度，還能夠增加植物可溶性糖和可溶性蛋白含量，促進植物產量的升高和抗逆性的加強，植物體內的鉀主要來源于土壤，而土壤的鉀素多以固定鉀和礦物鉀的形式存在，不能直接被植物根系吸收，這成為了制約植物生長所需鉀素營養的一大阻礙。解鉀菌作為土壤中常見的解鉀微生物，可以直接對土壤中礦化鉀進行轉化分解，其分解所產生的速效鉀養分可以被植物根系直接吸收，不僅為植物光合作用的順利進行奠定了物質基礎，還決定了植物的生長發育狀態。本研究結果表明，不同時期接種不同劑量的解鉀菌均可顯著增加滇重樓老根莖和新根莖內的鉀含量，其中，35.00 g(K3)解鉀菌的調控效果最佳，根莖中鉀素含量的提高說明了解鉀菌的施用促進了土壤中礦化鉀轉化為速效鉀，為植物體內鉀素含量的增加奠定了基礎。這與煙草幼苗接種不同特異性根際解鉀菌[25]或者將解鉀菌液與枸溶性鉀肥配施[10]均會促進葉片內鉀含量的積累研究結果相一致，可見，外源接種解鉀菌促進植物體內鉀素積累已是不爭的事實。

重樓藥材的多種藥理活性與其根莖內的礦質營養元素含量密切相關，如高含量的Mg能提高機體免疫力；Zn和Ca含量可能與重樓的生肌、止血、消炎作用有關[26]。中藥材內的重金屬超標問題已成為中藥國際化過程的重要障礙而廣受國內外的普遍關注，使用重金屬藥材會直接影響患者臨床用藥的安全和療效，土壤中的重金屬經藥用植物吸收后通過食物鏈進入體內，進而危害人體健康[1]。近年來根際促生菌調控植物元素吸收和轉運，促進植物體內營養元素含量升高，降低其可食部分重金屬累積的研究結果相繼被報道[27,28]。Zhang等[27]于滇重樓苗期接種不同叢植菌根真菌(AMF)，發現接種不同AMF可增加果熟期重樓藥材中Mg和Zn含量，并能降低重金屬Cu含量；Li等[28]于翅莢木苗期接種AMF，發現外源接種AMF能夠降低翅莢木體內Zn濃度，同時增加Zn的累積量。本研究結果表明，不同時期接種不同劑量的解鉀菌對滇重樓老根莖和新根莖內Mn、Mg和Zn含量均起到促進作用，而對重金屬Pb、Cu、As和Cd含量則起到抑制作用，并且解鉀菌對新根莖內營養元素和重金屬含量的調控效果好于老根莖。滇重樓根莖內Pb最高含量為1.54 g/kg、Cu最高含量為0.97 mg/kg、As最高含量為1.88 mg/kg、Cd最高含量為30.78 mg/g，根據中國對外貿易綠色行業標準《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》和2015版《中國藥典》限量標準規定，滇重樓藥材限量標準為Pb≤5.0 mg/kg、Cu≤20.0 mg/kg、As≤2.0 mg/kg和Cd≤0.3 mg/kg[29]，滇重樓中重金屬Pb、Cu、As和Cd含量均符合重金屬限量標準，這說明外源接種解鉀菌可以降低重金屬含量，改善滇重樓根莖的藥用價值，這為滇重樓藥材質量評價及道地藥材生產發展提供了理論依據。

4 結論

與CK相比，滇重樓苗期接種解鉀菌可顯著提高其根系活力，促進葉片內Chl、Car、可溶性蛋白和可溶性糖含量的增加，降低葉片內保護酶(SOD、POD和CAT)活性以及MDA含量，可見，滇重樓苗期接種解鉀菌可以有效地維持細胞膜系統的穩定性，進而促進滇重樓植株的生長發育。其中，接種35.00 g解鉀菌對滇重樓幼苗生長的促進效果最佳，17.50 g解鉀菌的調控效果次之。滇重樓苗期接種解鉀菌可以使老根莖和新根莖內的鉀含量顯著升高，促進老根莖和新根莖內營養元素Mn、Mg和Zn含量的增加，而重金屬Pb、Cu、As和Cd含量普遍降低，這說明滇重樓苗期接種解鉀菌可以促進其根莖內有益營養元素的積累，降低重金屬含量，提高滇重樓根莖的藥用價值。