不同產地山茱萸總皂苷及總環烯醚萜苷的地理變異分析

安淑靜，牛豆，王婷，韓彬凱，王紅菊，康杰芳

(陜西師范大學生命科學學院，教育部藥用資源與天然藥物化學重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西 西安 710119)

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)是山茱萸科山茱萸屬植物，又名山萸肉、棗皮、藥棗等，始載于《神農本草經》[1]，其干燥成熟果肉可入藥，具有補益肝腎、澀精固脫等功效[2]。研究表明山茱萸皂苷類和環烯醚萜苷類化合物是重要的生物活性成分，具有降血糖、抗氧化、抗炎、抗癌、神經保護、肝臟保護和腎臟保護[3-9]等作用。山茱萸主要分布在陜西、河南、浙江、山西、湖北和安徽等地。洑香香等[10]對4個地區7個山茱萸群體的種子形態指標變異、種子形態指標與環境因子的相關性、種子形態地理變異趨勢和群體聚類進行了探討，表明不同群體種子形態均存在顯著差異；種子寬度與體積呈顯著正相關，且二者與緯度呈顯著負相關；種子寬度和種子體積的地理變異趨勢明顯。焦媛等[11]采用ICP-MS法分析5個產區22種無機元素的差異性，發現山茱萸中無機元素的含量與產地存在高度相關性。其他研究也發現山茱萸產地與其生物活性成分存在一定相關性[12-14]。

以上對于山茱萸有效成分的研究表明了不同產地間含量存在差異，但少有對有效成分含量與不同產地具體環境因素相關性研究的報道。尋找影響活性成分含量的具體環境因子對于優良產區的選擇、品種選育、質量控制及規范化栽培有重要的指導作用。本研究對6個主產區15個產地的具體環境因素(緯度、經度、海拔、年降雨量、年均氣溫、年日照、無霜期)與山茱萸總皂苷和總環烯醚萜苷含量進行相關性和聚類分析，為山茱萸質量控制、優良產區篩選和規范化栽培等提供相關的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器

RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；MD-SpectraMax M5多功能酶標儀(Molecular Devices)；LG-04C微型植物粉碎機(瑞安市百信藥機器械廠)；XH-B型旋渦混合器(美堰市康健有限公司)；XO-200超聲微波反應系統(南京先歐儀器制造有限公司)；LC-2010A HT型高效液相色譜儀(日本 SHIMADZU)。

1.2 試藥

15批山茱萸藥材樣品的地理信息見表1，經西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室曹曉燕教授鑒定為山茱萸科山茱萸(CornusofficinalisSieb et.Zucc.)的成熟果肉。取山茱萸樣品，粉碎，過40目篩，備用。

表1 不同產地山茱萸地理位置特征

齊墩果酸標準品(sigma公司)；馬錢苷(批號：MUST-12052813)、獐牙菜苷(批號：MUST-13031124)、莫諾苷(批號：MUST-13070102)、山茱萸新苷(批號：MUST-12101526)均購于上海源葉生物科技有限公司，純度≥98 %；乙腈(色譜純)；冰乙酸(色譜純)；其余試劑為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 總皂苷樣液制備

稱取樣品1.00 g，70%乙醇提取，料液比為1∶21，超聲功率471 W，微波功率369 W，5 min，抽濾，正丁醇萃取，旋轉蒸發揮去正丁醇，定容至20 mL，備用，每個樣本重復提取3次。

1.3.2 總環烯醚萜苷樣液制備

稱取樣品1.00 g，80%甲醇提取，料液比為1∶21，超聲功率357 W，微波功率641 W，9 min，抽濾，甲醇補到原始重量，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用，每個樣本重復提取3次。

1.3.3 總皂苷含量的測定

總皂苷含量的測定參照CHEN等[15]的方法，略作改動。取齊墩果酸標準品2.00 mg，定容至10 mL。取不同量標準品液制成0.003 6、0.004 8、0.006 0、0.007 2、0.008 4、0.009 6、0.010 8、0.012 0、0.013 2、0.014 4 mg/mL濃度的樣品，水浴，冷卻后加入0.20 mL香草醛-冰醋酸、0.80 mL高氯酸，60℃水浴15 min。冷卻后加入5.00 mL冰醋酸，于550 nm下測吸光度。標準曲線為：A=0.037 6c-0.021 0，R2=0.999 2。吸取山茱萸樣品50 μL，相同的方法測定，取3次結果平均值為測定結果。

1.3.4 總環烯醚萜苷含量測定

HPLC色譜條件： Phenomenex luna ODS 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：35 ℃，波長：240 nm，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL。流動相：A (冰乙酸)，B(乙腈)；梯度洗脫：0～15 min，10%～20% B；15～19 min，20%～22% B；19～25 min，22%～25% B；25～35 min，25%～27% B；35～50 min，27%～70% B；50～55 min，70%～10% B。莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷的線性回歸方程見表2。在此條件下，測定各個成分的峰面積，計算各產地山茱萸藥材環烯醚萜苷的含量，取3次平均值即為測定結果。

表2 各成分線性回歸方程

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 不同產地山茱萸總皂苷和總環烯醚萜苷含量分析

表3顯示了15批山茱萸藥材中總皂苷和環烯醚萜苷的含量，不同產地之間含量存在顯著差異，其中總皂苷含量以河南西峽最高，其次為陜西佛坪；總環烯醚萜苷含量以浙江淳安最高，其次為河南西峽；總皂苷含量的變化幅度為13.55～26.65 mg/g，總環烯醚萜苷含量的變化幅度為23.05～32.68 mg/g。

表3 不同產地山茱萸總皂苷和總環烯醚萜苷含量

對表3進行多重比較分析，結果顯示15個產地間的山茱萸總皂苷和總環烯醚萜苷的含量存在顯著差異。河南西峽、陜西佛坪的總皂苷含量最高，分別為26.22 mg/g、25.80 mg/g。安徽石臺在所選的15個產地中含量最低，為13.55 mg/g，其中山西陽城、河南魯山、浙江淳安、陜西丹鳳、湖北?？?、湖北南漳和湖北鄖縣7個產地之間總皂苷含量無明顯差異，平均含量為17.86 mg/g。15個產地的總環烯醚萜苷含量多重比較分析表明，浙江淳安和河南西峽兩地的總環烯醚萜苷含量最高，分別為32.67 mg/g和31.68 mg/g，但和陜西丹鳳、佛坪等地差異不顯著。

2.2 地理因子相關性分析

采用Person對總皂苷和環烯醚萜苷與產地地理因子進行相關性分析。表4顯示山茱萸總皂苷含量與產地海拔、緯度和無霜期正相關，其中與海拔呈極顯著正相關(P<0.01)，與經度、年降雨量、年日照、年均氣溫負相關，其中與經度呈顯著負相關(P<0.05)，表明總皂苷含量隨著海拔的升高而增加，隨著經度的增加而減少，出現明顯的東西部地域分化即西高東低的趨勢；山茱萸總環烯醚萜苷與經度、年降雨量、年均氣溫、無霜期正相關，但相關性不顯著(P>0.05)，與海拔、緯度負相關，但相關性也不顯著(P>0.05)，與年日照無相關性，究其原因可能是由于不同產地對環境因子響應的差異性減弱了其相關性。圖1顯示總皂苷與經度、海拔之間的散點圖，Loess加擬合線，結果顯示山茱萸總皂苷含量隨產地經度的增加逐漸遞減，整體表現出西高東低的變化趨勢，而隨產地海拔的增加逐漸遞增，與其他5個地理因子之間不顯著相關；山茱萸總環烯醚萜苷含量與地理因子無顯著相關，表明次生代謝產物是植物與環境長期相互作用的結果[16]，各種生態因子對植物的次生代謝產物起一種連續的、動態的生態綜合作用，而不是單一的對植物起作用，影響著植物次生代謝產物的生成與動態變化[17-18]。

2.3 不同產地山茱萸總皂苷和總環烯醚萜苷含量的聚類分析

根據表4和圖1的結果，對15個產地山茱萸的總皂苷和總環烯醚萜苷與海拔、經度進行SPSS聚類分析，結果如圖2所示。15個產地的山茱萸種質資源大致可分為四類，第一類有4個產地，分別是：浙江臨安、安徽歙縣、安徽石臺、安徽霍山，其皂苷平均含量為14.58 mg/g，總環烯醚萜苷平均含量為27.18 mg/g；第二類有5個產地，分別是：河南鞏義、河南魯山、浙江淳安、湖北南漳、湖北?？?，其皂苷平均含量為17.28 mg/g，總環烯醚萜苷含量為30.32 mg/g；第三類有3個產地，分別是：湖北鄖縣、山西陽城、陜西丹鳳，其皂苷平均含量為17.69 mg/g，總環烯醚萜苷含量為27.57 mg/g；第四類有3個產地，分別是：河南內鄉、河南西峽、陜西佛坪，其皂苷平均含量為24.35 mg/g，總環烯醚萜苷含量為27.13 mg/g。在四類中，前兩類經度較大，海拔較高，且親緣關系和地理位置較近，又可聚為一大類，其皂苷及總環烯醚萜苷的平均含量為45 mg/g；后兩類經度相對較小，海拔較高，且山茱萸中總皂苷及總環烯醚萜苷的平均含量為53.37 mg/g，其中的陜西丹鳳、河南西峽、陜西佛坪的總皂苷及總環烯醚萜苷含量均較高，可作為山茱萸種質資源的優良產地。

表4 山茱萸總皂苷和總環烯醚萜苷含量與地理因子的相關系數分析

圖1 山茱萸總皂苷含量與海拔和產地經度間的關系

圖2 不同產地山茱萸總皂苷、總環烯醚萜苷的聚類分析圖

3 討論與結論

山茱萸為世界三大名貴木本藥材之一，其藥用和食用價值已具有1 500多年的歷史，控制其質量對山茱萸的開發應用意義重大。2015年版《中國藥典》以馬錢苷和莫諾苷含量作為山茱萸質量的控制標準[2]。然而，僅以馬錢苷和莫諾苷作為其質量的控制標準比較單一，缺乏全面性和系統性，尋找新的質量控制標準，有助于山茱萸類產品的深度開發，更好地應用于醫藥和保健行業。研究表明，山茱萸主要含有環烯醚萜苷、皂苷、有機酸、酯類、鞣質、黃酮和多糖等多種成分[19-21]。皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，陸地高等植物中含量較多，如人參、桔梗等，具有降血糖血脂、保護神經元、抗癌和保護腎臟等藥理活性；萬靜枝等[22]發現竹節參皂苷通過激活Sirt1蛋白抑制線粒體功能障礙來改善D-半乳糖對神經細胞的損傷；張紫薇等[23]從耐藥、抗炎和血管生成等多方面對薯蕷皂苷的抗癌機制進行闡述，為開發薯蕷皂苷的抗癌藥物提供理論依據。王娟[24]等和關悅等[25]發現，人參皂苷Rg3和苦瓜總皂苷均對糖尿病腎病大鼠有保護作用。鑒于皂苷的藥用價值，考慮亦可將總皂苷含量作為山茱萸質量控制的標準之一。環烯醚萜類化合物具有多種生物活性，其中馬錢苷、莫諾苷和獐牙菜苷是山茱萸中最主要的環烯醚萜苷成分。許多研究表明[26]山茱萸環烯醚萜苷中含量較高的馬錢苷與莫諾苷對保護神經元、抑制黑素和改善糖尿病有顯著作用。HE等[27-28]發現山茱萸中的馬錢苷，莫諾苷，熊果酸可以保護胰島β細胞免受高糖誘導的過度氧化應激和細胞凋亡；LV、JIANG等[29-30]發現山茱萸環烯醚萜苷還可以通過減少NF-κB及其下游合成酶和細胞因子的產生顯著減輕糖尿病器官損傷。因此，山茱萸中總皂苷和總環烯醚萜苷的含量，可為山茱萸質量控制提供重要參考依據。

山茱萸是多年生小喬木，喜生長在400～1 200 m海拔之間，主要分布于陜西、河南、浙江、安徽、山西和湖北，產地的不同，意味著海拔、溫度、氣候的差異性。本研究通過對不同產地山茱萸樣品中總皂苷與總環烯醚萜苷的測量，結果顯示不同產地間含量差異顯著，表明地理因子對山茱萸總皂苷和總環烯醚萜苷含量有著重要的影響；有效成分產地地理環境因子的相關性發現，總皂苷含量與產地經度呈負相關、與海拔呈正相關，東西地域間存在明顯的分化，即西部低于東部的變異趨勢。郭蘭萍[31]和NCUBE[32]研究表明，植物次生代謝產物受生態因素直接或間接的影響，如：產地氣候、環境、土壤等，具有明顯的地域特性；與海拔和地理位置有顯著的相關性。因此，不同產地的地理因子的差異是造成山茱萸次生代謝物含量不同的主要因素。

近年來，道地性藥材品質的提升是中藥現代化的基石，需要根據產地地理環境、自然氣候等自然環境特點對道地藥材種植進行合理規劃。因此，對于山茱萸資源發展和利用來說，探索山茱萸有效成分含量和環境因子的相關性將會為山茱萸道地性和有效成分形成的生態機制提供重要參考。在15個產地中，陜西丹鳳、佛坪和河南西峽的皂苷和環烯醚萜苷的含量均較高，可作為山茱萸種質資源的優良產地。