茜草科二型花柱植物滇丁香傳粉精確性研究

陳 燕,王順雨,游賢松,胡德美,姚仁秀,湯曉辛,王曉月,*

1 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025 2 貴州師范大學(xué)國家林業(yè)局西南喀斯特山地生物多樣性保護重點實驗室,貴陽 550025 3 貴州師范大學(xué)貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控重點實驗室,貴陽 550025

Darwin在《同種植物的不同花型》中首次提出異型花柱(heterostyly)植物在于促進型間授粉,自此異型花柱植物受到生態(tài)學(xué)家和進化生物學(xué)家的廣泛關(guān)注[1],關(guān)于異型花柱的進化及適應(yīng)意義主要有三種假說:(1)促進型間傳粉[2- 4],(2)通過減少型內(nèi)花粉的落置以阻止花粉浪費[5],(3)避免同型花雌、雄蕊間的相互干擾[5- 7],其中最核心在于促進型間花粉傳遞,從而促進異交提高傳粉精確性。異型花柱是由遺傳控制的花型多態(tài)性現(xiàn)象,分二型花柱(distyly)和三型花柱(tristyly),而二型花柱分長柱型(long-styled morph)和短柱型(short-styled morph)兩種花型[8-9]。二型花柱目前已在28個被子植物科199個屬中報道,并且在茜草科中報道最多[10]。交互式雌雄異位(reciprocal herkogamy)是二型花柱植物最典型的特征,兩種花柱型的性器官在空間上存在交互式對應(yīng)關(guān)系[8],并且在其他花部結(jié)構(gòu)通常表現(xiàn)出多態(tài)性,如柱頭裂片長度[11]、花粉粒外壁紋飾[12-13]、花粉數(shù)量[6]和花粉粒大小[14-15]等方面。二型花柱植物通常伴隨著自交不親和,僅花型間授粉才能結(jié)實[16]。自交不親和,促進型間授粉的原因可能在于柱頭上型間花粉的花粉管可以伸長進入子房。Baker[4]對Mirabilis的研究表明型間花粉能在柱頭上萌發(fā),順利通過花柱進入到子房,而型內(nèi)花粉不能長出柱頭表面或者在花柱道中終止生長。Wu等[17]發(fā)現(xiàn)Mussaendamacrophylla型間授粉的花粉管生長比型內(nèi)授粉和自花授粉都要快。邵劍文等[18]表明長柱型為母本,型間授粉的花粉管的生長速度明顯比型內(nèi)花粉的快,而在短柱型為母本,型間授粉的萌發(fā)率最高。

二型花柱植物促進異交,提高傳粉精確性,要求植物與傳粉者之間有更嚴格的機械匹配[19](mechanical fit, 即植物花與動物的傳粉器官在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的匹配,如植物的花冠管長和動物的吻長)。例如Primulasecundifora和Primulapoissonii是管狀花,體型大的紅腹熊蜂(Bombusfriseanus)的個體與報春花結(jié)構(gòu)更適應(yīng),將其吻深入花冠管基部吸取花蜜時,吻部會沾上花粉,而其在訪問其他花時吻部的花粉會觸碰柱頭,從而實現(xiàn)花粉的移出和落置,在2011年,2012年主要的訪花者是蜜蜂和體型小的紅腹熊蜂(個頭小,體型與報春花屬特征不匹配),導(dǎo)致柱頭上型間花粉的比例低,而2013年這兩種報春上主要的訪花者是體型大的B.friseanus,提高了柱頭上型間花粉的比例[20]。茜草科滇丁香屬滇丁香(Luculiapinceana)是典型的二型花柱植物,白色,細長管狀花,具有濃郁的香氣。萬友名等[21]研究發(fā)現(xiàn)滇丁香的有效傳粉者是小蜜蜂(ApisfloraeFabricius),其觀察訪花的時間是從8點到18點,忽略了晚上潛在的傳粉者；并且根據(jù)植物花部特征與蟲體特征機械匹配以及傳粉綜合征(pollination syndrome,即與吸引特定類型傳粉者相關(guān)的花部特征組, 例如管狀花冠、白色或者乳白色,具有濃郁的氣味,花蜜濃度相對較低等是典型的蛾類傳粉綜合征),A.florae可能不能為滇丁香進行有效的傳粉,更不能促進異交。二型花柱植物滇丁香是否能促進異交,并且是哪種動物進行有效的傳粉,需要進一步研究。本文主要探究以下問題:(1)比較自然居群中滇丁香長、短柱型植株的數(shù)量以及花部特征是否存在顯著性差異。(2)自然狀態(tài)下長、短柱型柱頭上的型間花粉、型內(nèi)花粉的數(shù)量及比例是否有顯著性差異。(3)型內(nèi)和型間授粉處理,比較二者花粉的萌發(fā)率和花粉管的長度是否有顯著性差異。(4)人工控制授粉檢驗滇丁香是否型內(nèi)親和。(5)進行訪花觀察,確定滇丁香有效傳粉昆蟲的類型,測定傳粉昆蟲的體型特征,并分析比較它是否與滇丁香的花部特征相匹配。

1 材料與方法

1.1 材料

滇丁香(Luculiapinceana)隸屬茜草科(Rubiaceae)滇丁香屬,是一種多年生常綠喬木或灌木。滇丁香主要分布于亞洲東南部,其中云南省的西南、西北、東南等地分布最為廣泛,生于海拔600—3000 m處的山坡、山谷、溪邊、林邊以及灌叢中。花期較長,一般在6—12月,花果期重疊。傘房狀的聚傘花序簇生枝頂,花序大而密集,株型優(yōu)美,枝葉翠綠,花開繁茂艷麗具芳香,具有一定的藥用價值,是一種極具觀賞價值和推廣前景的野生花卉資源。本研究供試材料為云南省文山州麻栗坡大錫廠老山省級自然保護區(qū)(104°49′ 62" E,23°94′ 8" N)的野生滇丁香。該地區(qū)屬于常年濕潤季風(fēng)氣候,多霧天氣,雨量充沛,季節(jié)分布不均,冬無嚴寒,夏無酷暑。

1.2 方法

1.2.1比較自然居群長、短柱型的植株數(shù)量與花部特征

為比較自然居群中滇丁香長、短柱型的植物數(shù)量是否有顯著性差異,我們將老山省級自然保護區(qū)山頂至山腳分5個居群(居群間隔約2 km),并統(tǒng)計每個居群長、短柱型的植株數(shù)量。

為比較滇丁香長柱型、短柱型花部特征,隨機選取長柱型與短柱型植株各30株,每株隨機選擇1朵花,用游標卡尺測量(精確到0.01 mm) 葉片長與寬,萼片長與寬,花長與寬,花瓣長與寬,筒深,筒直徑,開口直徑；然后將花縱向剖開以便于測量花冠管內(nèi)的花部特征:雌蕊長,雄蕊長,花藥長、寬與厚度,柱頭長、寬與厚度。為了比較長、短柱型花粉的大小,每個花柱型隨機選擇30株植株,每株用尖頭鑷子摘取1個成熟的花藥并固定在裝有75%酒精的2 mL離心管中。每個花粉液體樣本隨機取一滴置于載玻片上,分別用熒光顯微鏡拍照,每張圖片隨機選擇3粒花粉,用圖像分析軟件(Digimizer Version 4.6.0)測量花粉的長度(Length, 簡寫L)和寬度(Width, 簡寫W),那么花粉的長度為(L1+L2+L3)/3,花粉的寬度為(W1+W2+W3)/3。為了比較長、短柱型的單花花粉數(shù)量和胚珠數(shù),隨機選取長、短柱型的植株各30個,每個植株選取一個花苞,保存在裝有75%酒精的離心管中。在實驗室內(nèi),用鑷子將單花花苞的花藥和子房分開,分裝在不同的離心管中,對應(yīng)標記。用鑷子充分搗碎花藥并定容至2 mL,充分震蕩搖勻后,移液槍取5 μL液體滴于載玻片,在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計花粉的數(shù)量。每個樣本滴取三滴進行統(tǒng)計,花粉數(shù)分別記為a1,a2,a3,花苞中花粉的總數(shù)量 =(a1+a2+a3)/3 × 稀釋倍數(shù)。在解剖顯微鏡下觀察花苞中的胚珠,并統(tǒng)計胚珠數(shù)量。花粉胚珠比(P/O)= 單花花粉數(shù)量/單花胚珠數(shù)量。為比較長、短柱型的單花期,隨機選擇兩柱型植株各30株,每個植株上隨機選擇1個花苞進行標記,花苞開放記為第1 d,每隔1 d觀察花的狀態(tài),直至花朵凋落,記為單花期。

1.2.2比較長、短柱型的花粉活力和柱頭活性

為了比較長、短柱型的花粉活力和柱頭活性,兩種花型分別隨機選擇30個植株,每株隨機選擇1個次日開放的花苞進行標記,次日收集開放花朵的花粉與柱頭,用MTT染色法(3 -(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)- 2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)進行測定花粉的活力(有活力的花粉被染成深紫色)[22]。用過氧化氫液體測定柱頭活性(若有活性,柱頭周圍會產(chǎn)生氣泡,氣泡產(chǎn)生越多表明活性越強)[23]。

1.2.3自然種群植株柱頭上花粉的落置

選擇晴朗的天氣,隨機選擇長柱型、短柱型滇丁香各30株,每個植株選擇一朵花,用鑷子摘取其柱頭并裝入含有FAA溶液(formalin-acetic acid- 70% alcohol,體積比是5:5:90)的1.5 mL離心管中,帶回實驗室,用8 mol/L的NaOH溶液軟化4 h,然后鑷子充分搗碎柱頭呈均勻的懸濁液,置于高速(8000 r/min)離心機下離心5 min,棄上清液,定容至0.5 mL,用移液槍吸取離心管中的全部樣本溶液滴于載玻片上,置于光學(xué)顯微鏡下(Nikon E100)統(tǒng)計型間和型內(nèi)的花粉數(shù)量。

1.2.4不同花型花粉的萌發(fā)以及花粉管的生長

為了比較型內(nèi)授粉,型間授粉和混合授粉(自然種群植株柱頭上同時落置長、短柱型花粉,該授粉處理是模擬自然狀態(tài))是否會影響花粉的萌發(fā)以及花粉管的伸長,我們隨機選擇長、短柱型植株各30株,每個植株隨機標記3個花苞(綁以不同顏色的尼龍線加以區(qū)分),進行去雄套袋處理,直至柱頭成熟。選擇晴朗的天氣,從距離受體植株至少30 m以外的其他植株上選擇新鮮開裂的花藥,分別收集長、短柱型花粉作為花粉源。用小毛筆進行授粉,每個植株上進行3 種授粉處理:(1)型內(nèi)授粉,(2)型間授粉,(3)混合授粉(長短柱型花粉混合),每個成熟的柱頭涂滿花粉,然后重新套袋。6 h后收集柱頭,儲存在裝有FAA固定液的離心管中。在實驗室中,柱頭首先在蒸餾水中清洗3次,然后于室溫在8 mol/L 的NaOH 溶液中軟化4 h,再置于蒸餾水中漂洗3 min,再在苯胺藍溶液(0.1% 質(zhì)量濃度)中染色3 h。用熒光顯微鏡觀察柱頭,統(tǒng)計柱頭上花粉的總數(shù)量,萌發(fā)的花粉數(shù)量；對于花粉管的長度,先用熒光顯微鏡自帶的軟件拍照,然后再用圖像分析軟件(Digimizer Version 4.6.0)測量花粉管的長度[22]。

1.2.5人工控制授粉實驗

為檢驗滇丁香的繁育系統(tǒng)類型以及是否型內(nèi)親和,長柱型和短柱型植株分別作為母本(花粉受體)進行3種不同授粉(花粉供體)處理。隨機選擇長柱型、短柱型各30個植株,將每個植株上3朵形態(tài)發(fā)育一致的花苞進行標記,分別進行以下3種處理:(1)自然對照；(2)去雄,套袋,等到柱頭成熟時授異株同型花粉,檢驗型內(nèi)花粉是否親和；(3)去雄,套袋,授異株異型花粉,檢驗型間花粉是否親和。授粉處理選擇在晴朗的天氣進行。待果實成熟后野外收集果實帶回室內(nèi),在解剖顯微鏡下統(tǒng)計結(jié)實情況。計算公式:結(jié)實率=單果種子飽滿數(shù)/單果種子總數(shù) × 100%。

1.2.6傳粉昆蟲及其傳粉行為

野外隨機選擇5個居群,每個居群隨機選擇大約100朵開放的長、短柱型的滇丁香單花并標記(兩種柱型分別大約50朵)。在晴朗的天氣進行訪花觀察,觀察時間從早上7點到晚上10:30,每半小時為一個時間段,觀察并拍照記錄訪花昆蟲的種類和訪花者行為,記錄昆蟲訪問的花朵數(shù),統(tǒng)計每個居群中標記的花朵數(shù)。若訪花昆蟲將喙伸入到花冠筒中吸取花蜜,并觸碰到花藥和柱頭,則屬于有效傳粉者。訪花觀察的時間為2019年6月17號到7月15號,2020年7月12到8月12號。訪問頻率等于訪問次數(shù)/每朵花/h。

2020年7月選擇夜間晴朗天氣,利用高壓汞燈(450W,E40螺口,上海亞明1923自鎮(zhèn)流)在實驗地點誘捕滇丁香的主要傳粉昆蟲30只,固定并制作為昆蟲標本,用游標卡尺測量其體長、喙長、頭寬、觸角長、頭寬、胸部長、胸部寬、胸部厚、腹部長、翅展。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

不同的數(shù)據(jù)類型符合不同的函數(shù)分布,根據(jù)數(shù)據(jù)的類型,選擇相應(yīng)的分布函數(shù)進行分析。采用擬合優(yōu)度(G-test of goodness-of-fit)檢驗自然居群中長、短柱型滇丁香的植株數(shù)量是否偏離1∶1。為了比較長、短柱型滇丁香的花部特征,不同的授粉處理花粉管的長度,不同訪花昆蟲的訪問頻率是否存在顯著性差異,采用廣義線性模型(generalized linear model, GLM)中正態(tài)分布(normal distribution)恒等關(guān)聯(lián)函數(shù)(identity-link function)進行分析,花部特征,花粉管的長度,訪問頻率分別作為因變量,長、短柱型,不同的花粉來源、不同母本,不同的訪花昆蟲分別作為自變量。采用泊松分布(poisson distribution)對數(shù)關(guān)聯(lián)函數(shù)(loglinear-link function)比較長、短柱型的滇丁香的花苞中的總花粉數(shù)、胚珠數(shù),其中花粉數(shù)和胚珠數(shù)作為因變量, 兩種花柱型作為自變量。為了比較自然狀態(tài)下柱頭上落置的型間花粉和型內(nèi)花粉是否存在顯著性差異,用泊松分布-對數(shù)關(guān)聯(lián)函數(shù)進行分析,其中花粉數(shù)量作為因變量,不同的花粉來源作為自變量。采用二元Logistic關(guān)聯(lián)函數(shù)分析比較不同授粉處理柱頭上花粉的萌發(fā)率和不同授粉處理的結(jié)實率,柱頭上萌發(fā)的花粉數(shù)作為因變量, 柱頭落置的總花粉數(shù)作為一次實驗中總的變量, 不同的花粉來源、不同的母本作為自變量；飽滿種子數(shù)為因變量,種子總數(shù)為一次試驗中總的變量,不同授粉處理和不同柱型為自變量。本研究試驗數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 20進行分析,Origin 2018制圖。

2 結(jié)果

2.1 花部特征的比較

在自然居群中,滇丁香長柱型的柱頭裸露于花冠管外,柱頭所占位置明顯高過花藥；短柱型的柱頭隱藏于花冠管之中,花藥位置高于柱頭(圖1)。5個自然居群中滇丁香長、短柱型植株的數(shù)量沒有偏離1∶1(表1)。

圖1 滇丁香兩種表型的單花Fig.1 Single flower of two morphs of Luculia pinceanaL-morph:長柱型；S-morph:短柱型;標尺上邊是短柱型單花的解剖圖,標尺下邊是長柱型單花的解剖圖

表1 比較不同居群滇丁香長、短柱型植株數(shù)量(擬合優(yōu)度檢驗)

廣義線性模型(GLM)對不同花型花部特征進行比較分析結(jié)果表明:長柱型的筒深、筒直徑、開口直徑、雄蕊長、花粉粒體積、柱頭長顯著小于短柱型(P<0.01),而長柱型的葉片長、葉片寬、雌蕊長(花柱長)、柱頭厚均顯著大于短柱型(P<0.01)(表2)。長柱型和短柱型的萼片長、萼片寬、單花期、花長、花寬、花瓣長、花瓣寬、花藥體積、柱頭寬、花粉數(shù)、胚珠數(shù)、花粉/胚珠比沒有顯著性差異(P> 0.05)。兩種柱型的花粉/胚珠比(P/O)介于244.70～2588.00之間,根據(jù)Cruden[24]的標準,滇丁香屬兼性異交(Facultative xenogamy)類型。長柱型的雌蕊長和短柱型的雄蕊長沒有顯著性差異(Waldχ2=0.80,df=1,P=0.37),長柱型的雄蕊長和短柱型的雌蕊長沒有顯著差異(Waldχ2=2.70,df=1,P=0.10),表現(xiàn)出交互式雌雄異位的花部特征(表2)。

開花當(dāng)天長柱型的花粉活性(85.95±2.16)%和短柱花粉活性(88.34±2.16)%沒有顯著性差異(Waldχ2=0.61,df=1,P=0.43)。開花當(dāng)天長柱型、短柱型植株的柱頭呈黃綠色,柱頭二叉分開,均有可授性。

2.2 自然種群植株柱頭上花粉的落置

對自然種群植株柱頭上花粉的類型和數(shù)量分析發(fā)現(xiàn),柱頭上型間花粉的數(shù)量(1198.38±329.10)顯著低于(Waldχ2=38.13,df=1,P<0.001)型內(nèi)花粉的數(shù)量(3663.37±188.23),型間花粉所占的比例(24.65±1.59)%顯著低于(Waldχ2=340.97,df=1,P<0.001)型內(nèi)花粉所占的比例(75.35±1.59)%。其中,長柱型柱頭上型間花粉的數(shù)量(1001.77±206.47)顯著低于(Waldχ2=23.10,df=1,P<0.001)型內(nèi)花粉的數(shù)量(3895.07±425.65)。短柱型柱頭上型間花粉的數(shù)量(1395.00±290.82)顯著低于(Waldχ2=13.26,df=1,P<0.001)型內(nèi)花粉的數(shù)量(3431.67±456.13)。長柱型柱頭上型間花粉所占的比例(20.46±1.94)%顯著低于(Waldχ2=258.45,df=1,P<0.001)型內(nèi)花粉所占的比例(79.54±1.94)%。短柱型柱頭上型間花粉的比例(28.90±2.29)%顯著低于(Waldχ2=130.57,df=1,P<0.001)型內(nèi)花粉所占的比例(71.10±2.29)%。

表2 長柱型、短柱型滇丁香花部特征(平均值±標準誤)的比較(廣義線性模型)

2.3 不同花型花粉萌發(fā)以及花粉管生長的比較

對不同授粉處理花粉萌發(fā)率以及花粉管生長比較發(fā)現(xiàn),短柱型花粉在柱頭的萌發(fā)率(76.35±2.10)%顯著高于混合花粉(68.72±2.52)%和長柱型花粉(63.97±2.20)%的萌發(fā)率,其中混合花粉和長柱型花粉的萌發(fā)率沒有顯著性差異(Waldχ2=1.62,df=1,P=0.20)(圖2)。長柱型為母本的花粉萌發(fā)率(65.42±1.78)%顯著低于短柱型為母本的花粉萌發(fā)率(75.15±1.93)%,且花粉供體和花粉受體對滇丁香的花粉萌發(fā)率的影響有交互作用(表3)。不同花粉供體對滇丁香花粉萌發(fā)率的影響在不同的花粉受體間不同,長柱型為母本,授長柱型花粉的萌發(fā)率顯著低于授短柱型花粉和混合型花粉的萌發(fā)率(Wald χ2= 21.71,df=2,P<0.001),授短柱型花粉與授混合型花粉的萌發(fā)率沒有顯著差異(Waldχ2=2.43,df=1,P=0.12)；短柱型為母本,授長柱型花粉和授短柱型花粉的花粉萌發(fā)率顯著大于(Waldχ2=8.78,df=2,P=0.01)授混合花粉的萌發(fā)率,而授長柱型和授短柱型的萌發(fā)率沒有顯著性差異(Waldχ2=0.09,df=1,P=0.77)(圖2)。

對花粉管長度分析發(fā)現(xiàn),長柱型花粉(120.15±3.25)μm、短柱型花粉(117.13±3.25)μm、混合花粉(119.69±3.25)μm在柱頭上的花粉管長度沒有顯著性差異。長柱型為母本的花粉管長度(130.34±2.36)μm顯著高于短柱型為母本的花粉管長度(107.64±2.36)μm(Waldχ2= 46.13,df=1,P<0.001)(表3,圖2),且花粉供體和花粉受體對滇丁香的花粉管長度的影響沒有交互作用(表3,圖2)。長柱型為母本,授短柱型花粉跟混合授粉的花粉管長度沒有顯著性差異(Waldχ2=7.05,df=1,P=0.01),且都顯著高于(Waldχ2=25.26,df=1,P<0.001)授長柱型花粉的花粉管長度。短柱型為母本,授長柱型花粉的花粉管長度顯著高于(Waldχ2=36.93,df=2,P<0.001)授短柱型花粉和混合授粉的花粉管長度。

總體上看,在不同花粉受體上,型間授粉的花粉萌發(fā)率(76.76±2.07)%顯著性大于(Waldχ2=18.00,df=2,P<0.001)型內(nèi)授粉(63.63±2.19)%和混合授粉(68.72±2.50)%的花粉萌發(fā)率。型間授粉的花粉管長度(132.25±2.92)μm顯著性大于(Waldχ2=44.41,df=2,P<0.001)型內(nèi)授粉(104.94±2.92)μm和混合授粉(119.68±2.91)μm的花粉管的長度(圖2)。

圖2 不同處理滇丁香的花粉萌發(fā)率和花粉管長度的比較。長柱型花粉、短柱型花粉、混合型花粉分別為花粉供體, 長柱型和短柱型滇丁香分別作為花粉受體Fig.2 Comparisons of pollen germination and pollen tube length of pollen donors from L-morph, S-morph and Mix, with the L-morph and S-morph in Luculia pinceana as pollen recipients in vivo不同字母表示不同的授粉處理有顯著差異

表3 授粉處理(長柱型、短柱型和混合型的花粉),花粉受體(長柱型和短柱型分別為母本)及其交互作用對滇丁香柱頭花粉的萌發(fā)率、花粉管長度的影響(廣義線性模型)

圖3 不同授粉處理滇丁香結(jié)實率的比較 Fig.3 Comparison of seed sets of Luculia pinceana with different pollination treatments不同字母表示不同的授粉處理有顯著性差異

2.4 人工控制授粉試驗

滇丁香型間異交的結(jié)實率(83.13±4.75)%顯著高于(Waldχ2=31.52,df=1,P<0.001)型內(nèi)異交(28.41±4.63)%的結(jié)實率,與自然對照的結(jié)實率沒有顯著性差異(69.26±5.98)%(Waldχ2=2.97,df=1,P=0.09)。長柱型為母本,型間異交和自然對照的結(jié)實率沒有顯著性差異(Wald χ2= 1.46,df=1,P=0.23),均顯著性高于(Waldχ2=8.77,df=2,P=0.01)型內(nèi)異交的結(jié)實率。短柱型為母本,型間異交和自然對照的結(jié)實率沒有顯著性差異(Waldχ2=1.18,df=1,P=0.28),均顯著性高于(Waldχ2=32.11,df=2,P<0.001)型內(nèi)異交的結(jié)實率。長、短柱型自然狀態(tài)下結(jié)實率沒有顯著性差異(Waldχ2=0.45,df=1,P=0.51)(圖3)。

2.5 傳粉昆蟲及其傳粉行為

訪問滇丁香的昆蟲主要有三類:長喙條背天蛾(Cechenenalineosa,鱗翅目天蛾科條背天蛾屬),熊蜂(Bombussp.,膜翅目蜜蜂科熊蜂屬),蜜蜂(Apis,蜜蜂科蜜蜂屬)(圖4)。熊蜂和蜜蜂體型相對條背天蛾較小。三者的訪問行為也完全不同,條背天蛾訪花時,其飛至花冠口,長喙深入花冠管并取食花冠筒基部的花蜜,訪花過程中吻部會沾上花粉。熊蜂訪花時落至花冠管基部,直接進行盜蜜。蜜蜂大多時間只訪問短柱型花而較少訪問長柱型花,通常兩對胸足鉤住花藥,一對后足搭在花冠上維持平衡,用口器取食和盜取花粉。條背天蛾的訪問頻率為(0.04±0.06)次/花/h,熊蜂為(0.47±0.06)次/花/h,蜜蜂為(0.29±0.09)次/花/h。條背天蛾的蟲體特征見表4,其中吻長顯著大于長柱型滇丁香的筒深(Waldχ2=87.86,df=1,P<0.001),也顯著大于短柱型的花筒深(Waldχ2=6.86,df=1,P=0.01)(花筒深的數(shù)據(jù)見表2)。

圖4 滇丁香的訪花昆蟲Fig.4 Visiting insects of Luculia pinceana

表4 條背天蛾體型特征的測量(平均值±標準誤)

3 結(jié)論與討論

3.1 花部特征的多態(tài)性

二型花柱植物的花部形態(tài)特征具有多態(tài)性[2,6,13- 14],例如蕎麥屬(Fagopyrum)、紫草屬(Lithospermum)的花瓣大小在長、短柱型之間存在差異[2]。艷麗耳草(Hedyotispulcherrima)長柱型和短柱型的柱頭裂片長度、花粉大小和淀粉含量等具有多態(tài)性[11]。本研究在檢測花粉數(shù)量上表明,長、短柱型的花粉數(shù)量沒有顯著性差異,這種特征與許多二型花柱植物的特征不同[11,25],但與HedyotisacutangulaChamp的報道相似[15]。一般認為,二型花柱植物短柱型的花粉粒體積大于長柱型[11,14- 15,25-27],而我們的研究結(jié)果同樣支持這一結(jié)論。研究發(fā)現(xiàn),短柱型的柱頭表面積大于長柱型,這種型間不對稱性可能是由于短柱型的柱頭隱藏在花冠之中,位置較低,相比長柱型更難接收到花粉,因而短柱型通過增大柱頭表面積來提高花粉的接觸面積,從而彌補花粉流的不對稱性。滇丁香的葉片長、葉片寬、筒深、筒直徑、開口直徑,柱頭厚在長、短柱型間也表現(xiàn)出多態(tài)性,是植物保證繁衍順利而采取的一種生殖策略[28]。此外,我們發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下滇丁香長、短柱型植株的數(shù)量沒有偏離1∶1,這在異型花柱植物中是一種普遍現(xiàn)象,能避免雄性資源和雌性資源的浪費,有利于維持居群長期的穩(wěn)定[29]。

3.2 自然種群植株柱頭花粉的落置

Armbruster等[30]提出的不精確指數(shù)(inaccuracy index)報道了花粉流中相互作用關(guān)系,提出了精確的花器官交互式結(jié)構(gòu)更有利于型間花粉在柱頭上的落置[14]。在自交不親和的二型花柱植物中,型間花粉在柱頭上的比例直接反應(yīng)了型間授粉的成功率。本研究發(fā)現(xiàn)滇丁香雖有精確的交互式異位結(jié)構(gòu)特征,但自然種群植株柱頭上型間花粉的比例都低于30%,其他二型花柱植物中也有類似報道[17],這一結(jié)果似乎與前人提出的異型花柱交互雌雄異位結(jié)構(gòu)促進型間花粉精確傳遞的假說不一致。

自然植株種群柱頭上落置大量的型內(nèi)花粉可能是自花花粉或者同株異花花粉的干擾。有研究表明,沒有去雄情況下,報春花屬等柱頭上落置大量的型內(nèi)花粉[20]。但是,對蕎麥屬甜蕎(Fagopyrumesculentum)進行單花去雄(排除自花花粉的干擾)和整株去雄(排除同株異花花粉的干擾)處理后,發(fā)現(xiàn)柱頭上31.75%為型間花粉,17%為型內(nèi)花粉,柱頭上親和花粉比例增加,表明二型花柱植物可促進型間異交,提高傳粉精確性[31]。

3.3 花粉管萌發(fā)和繁育系統(tǒng)

二型花柱植物花粉的萌發(fā)及花粉管的伸長可能影響植物的繁殖成功[24-26,32-33]。Chen等[32]發(fā)現(xiàn)Mussaendashikokiana自交和異交的花粉管生長率差異不顯著。Nishihiro等[33]發(fā)現(xiàn)報春科自花花粉的萌發(fā)率明顯低于型間授粉,自花花粉和型間花粉的花粉管生長速率沒有差異。Klein[34]提出P.nuda型內(nèi)和型間花粉的萌發(fā)率及花粉管的生長是相似的,而張大愛等[35]研究表明commonbuckwheat型內(nèi)授粉的花粉管在柱頭或花柱中則是被抑制使結(jié)實率降低。本研究表明短柱型為母本,有利于花粉的萌發(fā),而以長柱型為母本,有利于花粉管的生長,自然狀態(tài)下長、短柱型的結(jié)實率沒有顯著性差異。在不同的花粉受體上,型間授粉的花粉萌發(fā)率和花粉管長度顯著大于型內(nèi)授粉,人工型間授粉的結(jié)實率相應(yīng)也顯著高于型內(nèi)授粉,綜合人工授粉結(jié)實和P/O比的結(jié)果,滇丁香是一種兼性異交植物。異型花柱植物具有典型的型內(nèi)(自交)不親和性[11,16],但也有一些二型花柱植物具有型內(nèi)親和[2],而一定的型內(nèi)親和也是對植物的一種生殖保障[36]。

3.4 植物花部特征與傳粉昆蟲蟲體的相互適應(yīng)

植物的花部特征反映了對某一類群傳粉者的適應(yīng)[19,37]。馬達加斯加的蘭科植物彗星蘭 (Angraecumsesquipedale)的花距長30—40 cm,依靠吻長約30 cm的天蛾為其傳粉[38]。石蒜科水仙(Narcissuspapyraceus)是管狀花,適應(yīng)于長吻的昆蟲為其傳粉,當(dāng)長吻昆蟲伸入花冠管基部吸蜜時,長、短柱型花粉就落置到昆蟲吻長的不同部位,隨后昆蟲在長、短柱型間互訪時就能成功的完成型間傳粉[39]。茜草科繡球茜(Dunniasinensis)的交互式雌雄異位結(jié)構(gòu)與其傳粉者(蜂類和蝶類)的體位相匹配,使得傳粉者頭部攜帶的是長柱型花的花粉,而腹部攜帶的是短柱型花的花粉,最終從而實現(xiàn)植物間的型間傳粉[25]。不過在二型花柱植物櫻草(Primulasieboldii)中發(fā)現(xiàn),狹窄的花冠筒結(jié)構(gòu)嚴格限制了的傳粉者的吻,使得植物與傳粉者無法完全的匹配,導(dǎo)致短柱柱頭上親和花粉的落置和結(jié)實率受到影響[40]。滇丁香主要是通過與其花冠管長度相匹配的長吻條背天蛾實現(xiàn)有效的傳粉,而小蜜蜂主要是收集花粉,并不能為滇丁香進行有效的傳粉。昆蟲的不同訪花行為對二型花柱植物適合度的影響是多樣和復(fù)雜的。長喙天蛾的傳粉效率還需要探究。熊蜂從花筒基部盜蜜和蜜蜂直接收集花粉是如何影響滇丁香的適合度以及傳粉精確性還需要進一步研究。

二型花柱植物滇丁香長、短柱型植物數(shù)量在自然居群中沒有顯著性差異,花特征表現(xiàn)為典型的交互式雌雄異位,自然狀態(tài)下柱頭上落置的型間花粉的數(shù)量顯著低于型內(nèi)花粉的數(shù)量。滇丁香通過有利于型間花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長從而提高型間授粉的結(jié)實,型內(nèi)授粉也有一定的結(jié)實。長喙條背天蛾的蟲體特征與滇丁香的花特征相適應(yīng),是其有效的傳粉者。前人對二型花柱植物提高傳粉精確性的研究大多比較了長、短柱型的花部特征,并檢驗是否自交親和,也有部分研究統(tǒng)計自然狀態(tài)下柱頭上花粉落置情況,以及比較型內(nèi)、型間花粉的萌發(fā)率和花粉管長度。對于滇丁香來說,本研究首次詳實地比較長、短柱型的花特征,包括單花的花粉數(shù)量、大小、花粉/胚珠等；通過不同的授粉處理,發(fā)現(xiàn)滇丁香在是有利于型間花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長而促進了型間授粉的結(jié)實；并首次比較條背天蛾、熊蜂、蜜蜂等昆蟲的訪花行為,確定條背天蛾是其有效的傳粉者。該研究為二型花柱植物可通過促進型間花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長而促進異交、植物花部特征與傳粉者蟲體特征機械匹配提供了新的例證。

致謝：感謝廣西植物所劉長秋副研究員、云南省文山州麻栗坡縣郭喜兵先生、貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院相孟達同學(xué)對野外實驗的協(xié)助。