結核桿菌顯微掃描儀在結核形態學鏡檢的診斷價值研究*

朱圣輝，廖乘勝，施旭東，楊鵬，張圣賢

（寧波舜宇儀器有限公司，浙江 寧波 315408）

據全國第五次結核病流行病學抽樣調查［1］，2010 年我國15 歲及以上人群活動性肺結核的患病率為459/10 萬，涂陽肺結核患病率為66/10 萬，我國仍是結核病高負擔國家。對于結核的實驗室檢查，目前可以用到的方法有很多，比如細菌學檢測中的直接涂片法和培養法，分子檢測中的GENE XPERT，免疫學檢測中的結核菌素試驗皮試，免疫球蛋白（IgG）檢測，T 細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）檢測等［2-4］。而細菌學檢測中的痰涂片檢查由于其操作簡便，結果直觀，成本低廉優勢，一直都是實驗室檢查中的常用方法，涂片發現抗酸桿菌，是結核診斷的有力證據［5-6］。

目前的痰涂片鏡檢的常用方法是萋-尼抗酸染色法，操作要求［7-8］鏡檢人員用100X 油鏡觀察每張玻片的50～300 個不同視野，特別是對于弱陽或陰性的標本，實驗室質控要求至少觀察300 個視野，這對鏡檢人員而言是很大的負擔，并且非常容易發生漏檢。而結核桿菌掃描儀可以掃描每張片子的至少300 個視野，并通過算法進行輔助診斷，極大的減輕了人工鏡檢的工作量。為驗證掃描儀的檢驗性能，本研究收集了痰液標本1 266例，采用人工直接涂片法和萋-尼抗酸染色法，隨后對比人工鏡檢的結果和設備掃描的結果，以液體培養法為金標準，研究掃描儀對于抗酸桿菌檢出的敏感性和特異性，探討掃描儀的應用價值。

1 資料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 中國寧波舜宇儀器有限公司生產光學顯微鏡EX30，采用100X 油鏡觀察；中國寧波舜宇儀器有限公司生產結核桿菌顯微掃描儀FS50。

1.1.2 試劑 中國珠海貝索生物技術有限公司生產抗酸染色液與痰消化液，美國BD 公司生產MGIT 培養試劑。

1.2 實驗過程

中國科學院大學寧波華美醫院2019 年3 月至6 月的結核門診患者1 266 例，按照標準［9］采集膿樣痰，干酪樣或粘液3～5 mL。

標本制備：用折斷的竹簽茬端挑取標本中干酪樣，膿樣或可疑部分在一張玻片上涂抹成10×20 mm 的卵圓形痰膜，隨后采用萋-尼抗酸染色法進行抗酸染色［5］。

鏡檢：染色后的片子晾干后放至結核桿菌顯微掃描儀進行掃描和結果判讀。將染色晾干后的涂片放入掃描儀的料盒，料盒放入掃描儀主機后選中需要掃描的標本進行掃描，隨后在軟件閱片界面進行結果審閱和記錄；機器判讀完成后，由經驗豐富的結核實驗室工作者對片子進行人工顯微鏡觀察，在100X 油鏡下連續觀察300 個不同視野，結核分枝桿菌在藍色背景下呈細長略帶彎曲的紅色桿狀。

結核桿菌顯微掃描儀工作原理：通過對痰涂片進行顯微掃描，并對掃描圖像進行結核分枝桿菌的識別，分類，最終提供輔助診斷結果。

結果判讀：萋-尼染色抗酸桿菌陰性：未發現抗酸桿菌；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（報告條數））：抗酸桿菌菌數1～8 條/300 視野；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（1+）：3～9 條/100 視野，連續觀察300 個視野；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（2+）：1～9 條/10 視野，連續觀察100 個視野；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（3+）：1～9 條/1 視野；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（4+）：≥10 條/1 視野。報告1+時至少觀察300 個視野，報告2+至少觀察100 個視野，3+、4+時至少觀察50 個視野。

液體培養：剩余痰液標本采用BACTEC MGIT分枝桿菌檢測儀進行培養檢測。在標本中加入與標本等量的NALC-NaOH 混合溶液；旋緊蓋子后渦旋震蕩30 s，室溫靜置15～20 min，勿超過20 min，以防殺死結核菌。在液化后的標本中加入pH6.8 的PBS 緩沖液至40～45 mL，3 000 g 離心15 min，緩慢倒棄上清液至廢液瓶。加入1～3 mL pH6.8 的PBS 緩沖液，重懸沉淀，處理后的標本接種到相應的培養管內進行液體培養。

結果判讀：如果儀器報告陽性，應按照液體培養基的要求對培養液進行涂片染色鏡檢。如果涂片檢查為抗酸菌陽性，則報告培養陽性；如果難以確定，可用革蘭染色法判定。如果涂片檢查發現有非抗酸菌存在，則報告污染。如果任何微生物皆未發現，應繼續培養；6 周培養儀器未報告陽性，則判定為培養陰性。如果抗酸染色陰性且沒有明顯污染的培養管，可以繼續觀察，幾天后，重復抗酸涂片［10-11］。

質量控制：要求每一批次涂片染色都要做陽性對照和陰性對照。用結核分枝桿菌（H37Rv,ATCC27294）作陽性對照。其他細菌如大腸桿菌的菌懸液可作為陰性對照。陽性對照的抗酸染色結果呈陽性，而陰性對照的抗酸結果為陰性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（）表示，用t檢驗；計數資料以百分率（%）表示。約登指數=靈敏度+特異度?1。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

顯微掃描設備的平均檢測時間為（1.5±0.2）min/例標本，人工鏡檢組為（4.2±1.1）min/例標本，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01）。以BD 液體培養法檢測結果為診斷結核的標準，結核桿菌顯微掃描儀的靈敏度和特異度分別為51.56%和96.94%，人工鏡檢的靈敏度和特異度分別為43.23% 和99.66%。顯微掃描儀的尤登指數為0.49，人工鏡檢的尤登指數為0.43。見表1。

表1 儀器鏡檢與人工鏡檢結果比較（例）

3 討論

抗酸涂片檢查是結核病實驗室最常用的檢測方法之一，在顯微鏡下發現抗酸桿菌，是診斷分枝桿菌的有力證據。因此萋-尼抗酸染色法常用于結核病的診斷［12］。傳統的萋-尼抗酸染色法流程是人工涂片染色，隨后人工鏡檢［13］。整體實驗流程費時費力［14-15］，特別是人工鏡檢環節，按要求，每個實驗人員每個工作日閱片量不能超過25 片，且連續閱片10～12 張后應休息20 min。但在實際工作中，很多結核病實驗室工作人員工作量大，經常存在單日閱片量超過25 張的情況。

以培養結果作為金標準，進而比較結核桿菌顯微掃描設備和人工鏡檢的檢測效率。顯微掃描設備與人工鏡檢的靈敏度分別為51.56% 和43.23%，特異度分別為96.94% 和99.66%，約登指數分別為0.49 和0.43。顯微掃描儀的診斷效率高于人工鏡檢。

本研究的1 266 例標本中，有58 例標本兩種檢測方法不一致，其中54 例標本人工鏡檢為陰性，結核桿菌顯微掃描儀陽性，4 例標本顯微掃描儀結果陰性而人工鏡檢為陽性。查找實驗結果發現，這58 例標本的陽性等級范圍都在1 條/300 視野至1+，其中顯微掃描儀漏檢的4 例標本，人工鏡檢結果分別為1 條/300 視野，1 條/300 視野，2 條/300 視野，3 條/300 視野。分析漏檢原因，結核桿菌顯微掃描儀只掃描300 個視野，而10×20 mm 的卵圓形的痰膜整體視野數量在5 000 個以上，因此陽性級別較低的標本可能會因為視野盲區而產生漏檢。如果增加掃描視野數量，就可以增加掃描儀的檢出率，降低漏檢率。分析人工鏡檢的漏檢原因，主要有兩點：一是視野盲區，二是鏡檢操作人員由于觀察遺漏和視覺疲勞。對比人工鏡檢和掃描儀的漏檢數量，兩種方法的每個標本視野數量基本一致，因此造成人工漏檢的主要原因是第二點。

綜上所述，結核桿菌顯微掃描儀鏡檢與人工鏡檢均屬于形態學鏡檢，顯微掃描儀鏡檢與人工鏡檢的特異度比較差異不明顯，敏感性上優于人工鏡檢，且極大的縮短了鏡檢時間，大大減輕了操作人員的工作量。因此結核桿菌顯微掃描儀用于結核實驗室涂片找抗酸桿菌的篩查，適宜在各級結核病實驗室進行推廣應用。