胎盤絨毛組織中金屬蛋白酶及血管內皮生長因子表達與復發性流產的關系

柳欒美 張天如 郭金霞 洛陽北方企業集團有限公司職工醫院婦產科，河南省洛陽市 471000

復發性流產指連續發生≥2次的自然流產，是育齡女性生育失敗的主要原因，嚴重者會導致不孕不育，對女性身心健康造成不良影響[1]。相關研究顯示，復發性流產的發生率占總妊娠女性的1%～5%，占早期流產病例的30%～40%[2]。復發性流產的病因目前尚未明確，已有研究報道的包括生殖器異常、免疫功能異常、遺傳、環境因素、胎兒染色體異常[3]。研究者發現，基質金屬蛋白酶(MMPs)家族參與調節滋養細胞浸潤和胎盤的發育過程[4]；血管內皮生長因子(VEGF)能夠促進孕早期胎盤絨毛組織中血管的生成[5]。本文探討了MMP-2、MMP-9及VEGF在復發性流產患者胎盤絨毛組織中的表達特點，旨在為闡明MMPs、VEGF與復發性流產的關系提供參考。

1 對象與方法

1.1 觀察對象 選取2018年3月—2019年10月間本院收治的復發性流產患者42例為觀察組。入選標準：(1)連續性流產≥2次；(2)染色體檢查正常，孕周≤12周，臨床資料完整。排除標準：(1)有復發性流產家族史的患者；(2)生殖系統異常的患者。年齡23～38歲，平均年齡(29.40±2.72)歲；妊娠天數57～74d，平均妊娠(63.08±10.35)d。收集同期自愿終止妊娠的孕早期流產者39例為對照組，年齡20～37歲，平均年齡(28.71±3.05)歲；妊娠天數56～76d，平均妊娠(63.71±9.95)d。性別、年齡在兩組患者間比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，患者自愿參與并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與HE染色。兩組孕婦均行負壓吸引流產術終止妊娠，術中收集胎盤絨毛組織標本，平均成兩份，將其中一份標本放入液氮中速凍后轉移至-80℃保存用于RT-PCR檢測；另一份標本在4%多聚甲醛溶液中固定后常規石蠟包埋，4μm連續切片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察兩組孕婦胎盤絨毛組織的形態結構。

1.2.2 胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA水平檢測。Trizol法提取胎盤絨毛組織標本總RNA，逆轉錄得到cDNA，用于RT-PCR反應模板。反應體系共20μl：上、下游引物各1μl、cDNA 1μl、Sybr Green熒光染料10μl、雙蒸餾水7μl。引物序列由上海澤葉生物科技有限公司設計合成，MMP-2上游引物5’-GTGTGTGTCTACCATCCTCGCA-3’，下游引物5’-GTGTCTG TCTGCGTAATCTTA-3’；MMP-9上游引物5’-CCCTTGTAGGCCAGGTGG-3’，下游引物5’-CCTCCTCACCTCCACCCG-3’；VEGF上游引物5’-GTCGTCTTTCAA GT ACCTAGGT-3’，下游引物5’-ACACTGTTCGGTTCCGCCACT-3’。反應條件：95℃ 10min，95℃ 2min，56℃ 40s，共40個循環，延伸72℃ 2min。擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH為內參計算MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA的相對表達量。

1.2.3 胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白水平檢測。取胎盤絨毛組織石蠟切片，常規脫蠟至水，3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶，高溫、高壓修復抗原。滴加鼠抗人MMP-2、MMP-9單克隆抗體，均為1∶500稀釋，兔抗人VEGF單克隆抗體(1∶300稀釋)，4℃過夜，次日滴加二抗：羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG，均為1∶1 000稀釋，室溫反應1h，DAB顯色、蘇木素復染，切片脫水、透明后封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照，Image pro plus 6.0進行定量分析，使用積分光密度(IOD)表示MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達水平。

2 結果

2.1 兩組胎盤絨毛組織形態結構比較 對照組胎盤絨毛形態規則，滋養細胞內外層結構完整、排列整齊，絨毛間質無水腫。觀察組胎盤絨毛形態不規則，滋養細胞外層萎縮融合、數量減少，內層異常增多、排列紊亂，絨毛內血管發育不良、間質水腫，血細胞總量減少，存在少量炎性細胞。見圖1。

圖1 兩組胎盤絨毛組織形態結構觀察(HE，×200)

2.2 兩組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA和蛋白表達水平比較 觀察組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組，VEGF mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 兩組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白表達水平比較

圖2 兩組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白免疫組化染色(SP ×200)

2.3 觀察組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9、VEGF表達的相關性分析 Pearson相關性分析顯示，觀察組胎盤絨毛組織中VEGF與MMP-2、MMP-9表達呈負相關(r=-0.695，P=0.000；r=-0.682，P=0.000)；MMP-2與MMP-9表達呈正相關(r=0.631，P=0.000)。

3 討論

復發性流產是常見的妊娠期并發癥，孕12周之前發生為早期復發性流產，孕12～28周發生為晚期復發性流產，是不孕不育的主要原因之一，嚴重影響女性身心健康[6]。復發性流產的病因繁多，包括遺傳因素、免疫應答異常、胚胎發育不良等，具體機制仍未明確。近年研究認為，孕期胎盤絨毛組織血管形成障礙、入侵蛻膜細胞滋養層是復發性流產的主要原因[7]。本文胎盤絨毛組織HE染色結果提示，復發性流產患者胚胎絨毛血管發育不良，滋養細胞分化水平異常導致滋養層厚度變薄，胎盤功能不全可能是復發流產的原因。

金屬蛋白酶是一類依賴鋅離子、鈣離子等金屬離子發揮催化活性的蛋白水解酶，能夠降解胞外基質。相關研究顯示，金屬蛋白酶與血管生成和侵襲性疾病的發生有關，能介導子宮內膜異位癥、惡性腫瘤的發生與發展[8]。其中MMP-2、MMP-9是孕早期滋養細胞進入子宮內膜的主要活性酶。孕早期絨毛外滋養細胞分泌MMP-2、MMP-9，降解胞外基質中Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白，為滋養細胞進入子宮內膜創造條件，確保妊娠持續。VEGF是促內皮細胞分裂原，能促進血管形成。孕期母體與胚胎的營養交換基礎為胎盤絨毛組織血管新生。研究發現，復發性流產患者子宮內膜組織中VEGF存在低表達，可能與孕早期自然流產的發生密切相關[9]。

本文結果顯示，觀察組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組，VEGF mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組。可推測胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9表達上調可能誘發滋養細胞對母體子宮蛻膜基質的過度降解，導致胎盤未發育完全時即從宮腔中提前脫離，導致復發性流產；VEGF表達下調會影響胚胎絨毛血管的正常生理功能，降低母體對胚胎的營養供應，與復發性流產存在關聯。相關性分析顯示，觀察組患者VEGF與MMP-2、MMP-9表達呈負相關，MMP-2與MMP-9表達呈正相關。提示VEGF與MMP-2、MMP-9可能共同參與了復發性流產的發生與發展，具體分子機制仍需進一步深入研究。