LncRNA SNHG17通過誘導上皮間質轉化促進結直腸癌轉移

耿長輝 張春玲 高萍 何苗 李慧峰 姚旖旎 劉穎新

結直腸癌是人類最常見、最具侵襲性的惡性腫瘤之一，是全球第三大癌癥致死原因［1-2］。雖然近些年來手術技術及藥物治療技術不斷進步，但結直腸癌患者的復發率及死亡率還是居高不下。因此，研究結直腸癌發展過程中腫瘤發生的分子機制，尋找新的有效治療靶點，對于提高患者生存率至關重要。

長鏈非編碼RNA是近十幾年來發現的長度超過200個核苷酸的非編碼轉錄本，沒有完整的功能性開放閱讀框［3-5］。近年來，其對細胞生物學行為的影響，尤其是對腫瘤細胞的影響，已逐漸引起人們的重視。越來越多的研究表明，lncRNA在腫瘤中異常表達，參與了腫瘤的發生與發展的過程［6-9］。

Small nucleolar RNA host gene 17（SNHG17）是lncRNA的成員之一。它位于第20號染色體q11.23上，長1 186 nt。最新證據表明，SNHG17與多種腫瘤的發生有關，包括骨肉瘤、卵巢癌、口腔鱗癌、前列腺癌和腦膠質瘤等［10-14］。然而，它們在結直腸癌發生與發展中的具體作用仍然知之甚少。在這項研究中，我們旨在探究lncRNA SNHG17在結直腸癌細胞系和組織中的表達情況及其對結直腸癌的調控作用，爭取為結直腸癌治療尋找一個新的靶點。

材料與方法

一、細胞系

人正常結腸上皮細胞系NCM460和人結腸癌細胞（HCT116，HT29，SW480，SW620）購自the American Type Culture Collection（ATCC，馬納薩斯，美國）。人結腸癌細胞系LOVO購自上海生物科學研究所（上海，中國）。HCT116和SW480在添加10%胎牛血清（GIBCO，Carlsbad，CA）的McCOY's 5a培養基（江蘇凱基生物科技有限公司，中國）和Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）培養基（GIBCO，美國）中培養。所有細胞在37°C的含5%CO2濕培養箱內培養。

二、細胞轉染

過表達病毒和Lenti-shSNHG17及其相應的對照載體是從吉凱公司（上海，中國）購買的。轉染后，利用嘌呤霉素（Sigma，美國）進行篩選傳代獲得穩轉細胞株。shRNA序列如下：（shNC：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'； shSNHG17-1： 5'-GAUUGUCAGCUGACCUCUGUCCUGU-3'；shSNHG17-2：5'-CGUGUCUUCAAGAAGGGCUGAGCU-3'）。

三、RNA提取和qRT-PCR實驗

用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）從結直腸癌細胞系中提取總RNA，并根據生產廠家的說明，用高容量cDNA逆轉錄試劑盒（Applied Biosystems， CA） 逆 轉 錄 2 μg 總 RNA。 用Nanodrop 2000光譜儀（Thermo Fisher Scientific）測定DNA濃度。定量PCR用0.8 μg cDNA與SYBR Green試劑（Thermo Fisher Scientific，USA）應用Biosystem 7500qPCR系統（Applied Biosystems）進行qPCR擴增。以β-actin為內源基因，用2-ΔΔCT方法比較相對表達。引物序列如下：

SNHG17-F：5'-GTTCCTGGGGCTTGGATGAT-3'SNHG17-R：5'-GATCTAAGGCTGAGACCCACG-3'GAPDH-F：5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'GAPDH-R：5'-GCCCAATACGACCAAATCC3'

四、Transwell侵襲實驗

在小室上層鋪入基質膠后，于孵箱靜置4小時后，在小室上層中加入200 μL無血清培養基，并接種2×105個結直腸癌細胞，下層中加入600 μL的完全培養基。培養24～48小時后，用多聚甲醛固定下層細胞15分鐘，并用0.1%的結晶紫染色。用Nikon顯微鏡拍照，用Image J軟件計算細胞數。

五、劃痕實驗

在六孔板中接種2×105個結直腸癌細胞，待細胞長到100%密度的時候，用200 μL的槍頭進行劃線。用PBS洗滌細胞碎片及懸浮死細胞后分別于0小時和48小時用顯微鏡拍照，用Image J軟件計算面積。

六、Western blot實驗和抗體

采用蛋白質印跡法在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上分離蛋白質，然后將其轉移到硝酸纖維素膜上。將印跡與抗體在4°C下孵育過夜。洗滌三次后，將膜與二抗在室溫下孵育2小時。蛋白條帶通過ECL（北京，中國）可視化。

抗體使用及來源如下：Vimentin（Cell Signaling Technology＃ 5741）， N-Cadherin（Cell Signaling Technology＃#13116），E-Cadherin（Cell Signaling Technology＃#3195），GAPDH（ZSGB-Bio＃TA-8）。

七、數據庫

GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）是一種癌癥表達譜數據的交互式web服務器。GEPIA包含腫瘤/正常組織的差異表達分析、不同癌癥類型或病理階段的分析、生存分析及相關性分析。本研究利用了GEPIA的差異表達分析分析了數據庫中結直腸癌患者的腫瘤組織及正常組織的SNHG17的表達水平。

八、統計學方法

所有統計分析均采用SPSS 23.0軟件進行分析（IBM）。數據表示為至少三個獨立實驗的平均標準偏差。兩組之間采用t檢驗或方差分析。Prism software version 8（GraphPad軟件）用于繪圖。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、SNHG17在結直腸癌細胞系及組織中高表達

首先，利用GEPIA數據庫分析了SNHG17在結直腸癌患者正常組織和腫瘤組織中的表達，發現其在腫瘤組織中的表達要明顯上調（圖1A）。隨后提取了結腸癌細胞系和正常結腸上皮細胞的RNA，通過逆轉錄及qRT-PCR發現lncRNA SNHG17在結直腸癌細胞系中表達也明顯增高（圖1B）。而后分別將表達水平最低的SW480細胞進行SNHG17的過表達（圖1C），表達水平最高的HCT116細胞進行SNHG17的敲降（圖1D），進行后續的功能實驗。

圖1 LncRNA SNHG17在結直腸癌中的表達情況及穩轉細胞系的構建。1A：結直腸癌組織中SNHG17的表達水平；1B：qRT-PCR分析各結腸癌細胞系SNHG17的表達水平；1C，1D：qRT-PCR檢測慢病毒轉染構建穩轉細胞系SNHG17表達水平。P＜0.05表示為*；P＜0.01代表為**；P＜0.001表示為***

二、SNHG17促進了結直腸癌細胞的遷移與侵襲

進行劃痕實驗并進行分析，發現過表達SNHG17后細胞的遷移能力明顯增加（圖2A），敲降SNHG17后細胞的遷移能力明顯下降（圖2B）。Transwell侵襲實驗也表明隨著SNHG17的表達增加，其侵襲能力明顯增強（圖2C）。當敲降SNHG17后，其侵襲能力明顯下降（圖2D）。

圖2 LncRNA SNHG17在結直腸癌中的作用。2A，2B：劃痕實驗驗證各細胞系遷移能力；2C，2D：Transwell實驗驗證各細胞系侵襲能力。P＜0.05表示為*；P＜0.01代表為**；P＜0.001表示為***

三、SNHG17誘導結直腸癌細胞發生上皮間質轉化

上皮間質轉化是腫瘤細胞轉移能力的重要原因之一。為探討SNHG17促進結直腸癌細胞轉移的機制，我們進行western blot實驗，發現當SNHG17表達增加的時候，間質細胞標志物N-cadherin和Vementin的表達水平明顯增加，上皮標志物E-cadherin的表達水平明顯下降（圖3A）。我們還發現當敲降SNHG17的時候，間質細胞標志物N-cadherin和Vementin的表達水平明顯減少，上皮細胞標志物E-cadherin的表達水平明顯上升（圖3B）。SNHG17促進了結腸癌細胞的上皮間質轉化。

圖3 SNHG17促進了結直腸癌細胞上皮間質轉化。3A，3B：Western blot實驗分析各細胞系蛋白表達水平

討 論

結直腸癌因其高發病率和高死亡率一直是癌癥工作者研究的熱點話題。在結直腸癌發生與發展中的關鍵分子及機制有望提升患者的治療與預后價值。近些年來，長鏈非編碼RNA在結直腸癌中發生的作用也越來越多。有學者發現了m6A誘導的lncRNA GAS5對YAP信號的衰減在結直腸癌進展中的新機制可能為CRC治療提供了一種有前景的途徑［15］。還有研究表明lncRNA GLCC1在糖饑餓下在CRC細胞中顯著上調，通過與HSP90伴侶直接相互作用穩定c-Myc轉錄因子的泛素化，并進一步指定c-Myc靶基因（如LDHA）的轉錄修飾模式，從而促進糖酵解來支持細胞生存和增殖［16］。另外，m6A誘導的lncRNA RP11通過上調Zeb1促進結直腸癌細胞的擴散［17］。然而lncRNA SNHG17在結直腸癌轉移中的機制還鮮有報道。我們前期通過TCGA數據庫分析發現lncRNA SNHG17在結直腸癌腫瘤組織中高表達，并且通過qRT-PCR證明其在結直腸癌細胞株中表達也上調了。而后我們進行功能實驗，通過敲降和過表達SNHG17證明了lncRNA SNHG17可以促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲。上皮間質轉化指上皮到間質細胞的轉化，它賦予細胞轉移和侵襲的能力，包括干細胞特征、減少凋亡與衰老和促進免疫抑制，不僅在發育過程中起著關鍵的作用，而且還參與組織愈合、器官纖維化和癌癥發生等過程［18-20］。為了探究SNHG17與上皮間質轉化之間的關系，我們通過western blot實驗驗證了lncRNA SNHG17促進了間質細胞標志物N-cadherin和Vementin的表達，抑制了上皮細胞標志物E-cadherin的表達，誘導了上皮間質轉化的發生。以上研究表明lncRNA SNHG17通過誘導上皮間質轉化促進了結直腸癌細胞的遷移及侵襲。

本研究中尚有未解的科學問題：（1）lncRNA SNHG17在結直腸癌中表達增高的機制或者原因是什么；（2）lncRNA SNHG17通過什么分子機制誘導了上皮間質轉化：由于lncRNA無法編碼蛋白，故其產生的生物學功能最終的效應一定是改變了下游的相應蛋白，可以進一步去研究lncRNA SNHG17通過何種靶蛋白進一步影響了上皮間質轉化；（3）lncRNA在細胞和組織內的定位如何：如果是主要在細胞核中表達，它能否通過調控染色質層面或者組蛋白修飾水平等調控下游基因的表達；如果主要在細胞質中表達，是否調控蛋白質的翻譯或翻譯后修飾，是否通過ceRNA機制調控下游靶基因的表達。以上三個問題都有待進一步的研究去闡明。