利用13C標記和自然豐度三源區分玉米根際CO2釋放*

孫昭安，張保仁，何敏毅，王開永，胡正江，陳 清，孟凡喬?

（1. 濰坊學院生物與農業工程學院，山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東濰坊 261061；2. 中國農業大學資源與環境學院，農田土壤污染防控與修復北京市重點實驗室，北京 100193；3. 桓臺縣農業農村局，山東桓臺 256400）

土壤碳庫包括有機碳（Soil organic carbon，SOC）和無機碳（Soil inorganic carbon，SIC）庫，全球1 m深土層碳儲量分別為1 350和950 Pg C，SIC含量以CaCO3占絕對優勢[1]。我國SIC庫儲量（60 Pg C）是SOC庫量（50 Pg C）的1.2倍，主要分布在西北和華北地區[2]。通常認為SIC較為穩定，以往研究土壤碳循環多集中在SOC方面，較少考慮SIC的作用[3-4]。隨著土壤碳循環研究的深入，人們發現SIC也可以成為碳源（碳酸鹽溶解釋放）[4-5]或碳匯（次生性碳酸鹽形成）[3，6-7]。然而，以往大多數研究忽略了SIC溶解對土壤CO2的貢獻，這可能導致對SOC分解的高估，勢必造成SOC激發效應評估的不確定[8-9]。

土壤原有碳庫背景值很大，土壤碳庫的短期變化相對較小，很難直接通過測定土壤碳含量來定量土壤碳庫的短期改變，測定土壤CO2的釋放是其中比較有效的間接方法[10]。在種植植物的石灰性土壤上，土壤CO2釋放源有三個，即外源根源呼吸以及土壤SOC分解和SIC溶解的釋放，三源區分CO2是定量土壤碳平衡和SOC激發效應的前提。三源碳釋放體系的存在，給土壤CO2區分研究帶來挑戰，準確三源劃分CO2已成為土壤碳釋放和平衡評估研究的難點[11-12]。相對于傳統的兩源區分，三源區分還缺乏系統研究，在石灰性土壤上的研究更是較少[13-14]。

本研究以華北平原石灰性農田土壤為研究對象，利用13C示蹤結合自然豐度法，區分玉米根際土壤CO2的來源。研究在玉米關鍵生育期（拔節期、抽穗期和灌漿期）進行13CO2脈沖標記，先利用13C示蹤技術量化玉米轉移到地下各組分（根系、SOC和土壤CO2）的光合碳量，用兩源法區分根際土壤釋放CO2中源于根系和土壤的比例[15]，進而利用秸稈碳、SOC和SIC之間的δ13C差異，借助13C三元混合模型，把土壤總碳的分解拆分為SIC溶解與SOC分解[16-17]，以期提高華北石灰性農田土壤碳預算評估的準確性。

1 材料與方法

1.1 玉米種植

玉米盆栽在中國農業大學西校區溫室進行。供試土壤取自中國農業大學曲周試驗站農田（0～20 cm），為始成土，具有粉質壤土結構（砂粒62%，粉粒28%，黏粒10%），相關性質見表1。土壤風干后，磨碎、挑根，過5 mm篩。每盆（直徑20 cm×高度35 cm）裝風干土9.5 kg，盆內土層深度約27 cm。按N 0.55、P 0.19、K 0.31 g·kg–1風干土的比例預拌肥料（相當于耕層的田間肥料施用量），作為底肥一次性施入。播種前先將玉米（Zea maysL.，紀元1號）種子放在清水中浸泡12 h，然后再取兩粒淺埋入盆內土壤中。幼苗生長至三葉期時，每盆留1株。用稱重法控制土壤水分，根據玉米不同生育期對水分的需求特點，分別在苗期（播種后0～23 d）、拔節期（24～53 d）、抽穗期（54～66 d）和灌漿期（67～99 d）四個階段，調整土壤含水量為田間持水量（0.31 g·g–1）的60%、70%～75%、75%～80%和 70%～75%。

表1 供試土壤的理化性質 Table 1 Physical and chemical properties of the test soil

1.2 13CO2脈沖標記

分別在玉米出苗后29 d（拔節期）、57 d（抽穗期）和72 d（灌漿期）進行標記。每次選取3盆玉米，放入透明塑料制成的密閉標記室進行13CO2脈沖標記[15，18]（圖1）。（1）標記前，連接CO2吸收裝置，讓標記過程中根際呼吸產生的13CO2匯聚在盆內；（2）將盆內土壤和隔板間的空氣與標記室空氣隔開，隔板和PVC柱的接合處用凡士林密封，并在玉米基部與隔板的間隙中涂上凡士林密封；（3）檢查密閉性：將氣球套在一空心管上，在另一端管口用吸耳球鼓氣，根據氣球膨脹狀態判定密封性好壞，然后將空心管管口堵住；（4）將風扇、玉米植株和13C豐度為98%的Ba13CO3放入標記室內，然后將整個標記室密封；（5）標記于上午09：00點開始，用注射器向裝有Ba13CO3的燒杯中注入一定量1 mol.L–1的HCl溶液（根據Ba13CO3計算HCl的用量），然后開始標記。此后每隔一段時間，根據CO2檢測儀的讀數確定是否加入鹽酸，當CO2的濃度低于200×10–6時，向燒杯中注入HCl，維持CO2濃度在360×10–6左右，標記時間持續7 h。

1.3 玉米根際CO2釋放的取樣和測定

在27 d的示蹤期內（從玉米開始標記到破壞性取樣），用中性硅酮膠對隔板和PVC盆的接合處進行密封，在莖與隔板的間隙同樣涂抹真空絕緣硅樹脂（圖1）。每3天更換1次3.5 mol·L–1的NaOH溶液，在27 d示蹤期內共進行9次動態取樣，定期用空氣泵在土壤與隔板間注入一定量無CO2的空氣，為玉米地下部提供氧氣。以酚酞作指示劑，用稀鹽酸滴定NaOH溶液中未參加反應的NaOH，根據稀鹽酸和NaOH的體積、濃度，計算土壤CO2釋放量。將過量BaCl2溶液加入到土壤CO2的NaOH溶液中，形成BaCO3沉淀，于60 ℃下烘干至恒重，將每次取樣的BaCO3沉淀等比例混合，攪拌混勻形成BaCO3沉淀懸濁液，用注射器先吸取適量懸濁液，然后吸取3 mL 2 mol?L–1的H2SO4溶液，化學反應生成CO2，將針頭立刻插入到帶橡皮塞的5 mL真空采氣瓶中，待注射器中生成的CO2達到7 mL時，拔出針頭，把CO2注入到采氣瓶中，用DELTAplusXP型質譜儀測定CO2-δ13C值。

1.4 植株與土壤的取樣和測定

經過27 d的示蹤期，分別在玉米出苗后56、84和99 d時，破壞性取樣，從玉米基部剪斷植株，將盆中土壤反復過2 mm篩，剔除根系、研磨，過0.15 mm篩，測定根系的δ13C值。取約20 g土壤置于白色板上，剔除殘留細根后加入50 mL的3 mol·L–1的HCl溶液，用于去除土壤中的碳酸鹽。充分攪拌并靜止2 d后，以3 000 r·min–1的轉速離心3 min，將上清液倒掉，重復此過程，洗至上清液中性為止，并將酸化前的上清液倒回燒杯中，在60℃條件下烘干，研磨，過0.15 mm 篩，用DELTAplusXP型質譜儀測定SOC-δ13C值。SIC-δ13C值測定：在70℃，于真空系統中將土壤樣品與100%的H3PO4反應3 h，用DELTAplusXP型質譜儀分析生成CO2的δ13C值。碳同位素值采用PDB（Peedee Belemnite）標準。

1.5 計算方法

1）量化地下部的光合碳輸入和兩源區分根際CO2釋放（13C脈沖標記法）[15，19]。

分別在拔節期、抽穗期和灌漿期，對玉米進行13C脈沖標記后，地上部光合固定的13C轉運到地下部各組分，包括根系、根際沉積物和土壤CO2釋放，則進入地下各組分的13C量為：

式中，13Ci和Ci分別為各組分的13C量（mg·pot–1）和C量（g·pot–1），Fi和FNL為各組分標記和不標記的13C百分含量。

各個時期輸入到地下各組分的光合碳量（g·pot–1）：

式中，CΔ地上部為各生育時期內地上部的生物碳量變化，以地上部作為參照是考慮到地上部的生物碳量可以準確定量。

通過式（2）定量根源呼吸（CRoot），進而土壤CO2（CT）劃分為土壤源CO2（CSoil）和根源呼吸：

式中，FRoot和FSoil分別為根源呼吸和土壤總碳釋放占根際釋放CO2的比值。

2）根據玉米根碳、SOC與SIC之間的δ13C差異（分別為–14.1‰、–3.4‰和–22.2‰），借助13C三元混合模型，進一步兩源劃分土壤源CO2（13C自然豐度結合13C脈沖標記法）[16-17]。

式中，FSIC和FSOC分別為SIC源和SOC源CO2占根際CO2釋放的比值（未知量），2COδ、δRoot、δSIC和δSOC分別為根際釋放CO2、根系、SIC和SOC的δ13C值（已知量）。

1.6 數據分析

采用Excel 2013軟件作圖，圖數據的表達形式為平均值±標準誤。方差分析采用SPSS 17.0軟件計算。生物量、根系占植株干重的比值、光合13C分配在不同生育期的之間的顯著性差異分析比較采用最小顯著差異法（Least Significant Difference，LSD；P<0.05水平）。

2 結 果

2.1 不同生育期玉米生物量變化

玉米從拔節到灌漿期，根系生物量無顯著變化，而地上部和整個植株生物量在抽穗期達到最大，然后維持不變（圖2a）。從拔節期到灌漿期，根系生物量/整個植株生物量的比值顯著遞減（圖2b）。

2.2 玉米生長向地下部輸入的光合碳

在玉米關鍵生育期進行13C脈沖標記，地上部保留了大部分的光合13C，并且隨著玉米生長，地上部的13C分配比例顯著增加，而輸入到地下部的13C分配比例顯著遞減（圖3）。從拔節期到灌漿期，玉米地上部輸入到地下部各組分（根系、根際沉積碳和根源呼吸）的光合碳量呈遞減趨勢，拔節期的各組分碳輸入顯著高于后兩個生育期，后兩個生育期之間無顯著差異（圖4）。

2.3 兩源和三源法區分玉米根際CO2釋放

基于13CO2脈沖標記量化的根源呼吸量（圖4），玉米根際的CO2可以劃分為根源和土壤源CO2。從玉米拔節期到灌漿期，根源呼吸占土壤CO2的比例 呈降低趨勢，即從拔節期的66.7%降低至灌漿期的25.8%，在該生長階段，根源呼吸累計排放量占土壤CO2的比例約為50%（圖5）。

在兩源法區分根際CO2的基礎上（圖5），借助13C三元混合模型（13C自然豐度法），將土壤源CO2進一步拆分為SOC和SIC源CO2（圖6），發現SOC 和SIC源CO2占土壤CO2的貢獻比例在灌漿期較高（SIC和SOC源的貢獻比例分別為44.1%和30.1%），在前兩個生育期較小（SIC和SOC源的平均比例分別為23.1%和13.2%）。從拔節期到灌漿期，SOC和SIC源的累計CO2占根際CO2排放的貢獻比例約為30%和20%。

2.4 土壤碳收支平衡

從拔節期到生育期末，玉米生長對土壤轉移的光合碳量為17.1 g·pot–1（根系+根際沉積物），土壤本身碳（SOC+SIC）釋放碳量為12.9 g·pot–1，因此土壤凈固定碳量為4.2 g·pot–1（土壤光合碳輸入量減去土壤本身碳釋放；圖7）。

3 討 論

3.1 三源區分土壤CO2的方法比較

區分土壤CO2是量化根源呼吸和土壤本身碳釋放的前提，13C/14C同位素可以有效劃分CO2的排放來源[10，12]。由于單一13C/14C通常僅可以兩源區分土壤CO2，相對于傳統的兩源法，三源法區分CO2技術挑戰較大，一直是研究土壤有機質激發效應的難點。通過同位素三源區分土壤CO2組分，一般通過如下7種途徑（表2）：1）穩定同位素溯源軟件[20-21]，2）附加法[13-14]，3）13C源合并和組合法[22]，4）13C和18O自然豐度法[23]，5）14C標記結合13C自然豐度[11-12，24]，6）14C和13C雙標記[25-26]，以及7）13C標記和自然豐度[16-17]。根據同位素線性混合模型，n個同位素，僅適用于精確區分n+1個源的貢獻比例[20]，因此，采用13C和14C兩種C同位素（14C標記結合13C自然豐度、14C和13C雙標記），可以較為精確三源區分土壤CO2釋放來源。在以上區分方法中，最精準的是14C和13C雙標記方法，它可以克服13C自然豐度方法中同位素分餾效應的干擾，也不需要特定的C3/C4植物和土壤條件[25-26]。然而，14C材料有一定輻射危害，受到高度監管，僅限于室內實驗[18]。與14C和13C雙標記相比，利用不同13C豐度的材料是一個替代方案，例如本研究采用13C標記玉米和13C自然豐度方法三源區分的根際土壤CO2[16-17]：首先13C標記玉米量化根源呼吸和土壤源CO2比例[15]，然后借助13C三元混合模型（13C自然豐度玉米），將土壤源CO2進一步劃分為源于SOC和SIC的貢獻比例。這個方法中由于土壤碳（SOC和SIC）與13C自然豐度根系之間的δ13C差異太小，13C分餾效應存在一定不確定性[22]。

表2 三源區分土壤釋放CO2的方法比較 Table 2 Comparison of the methods for partitioning soil CO2 emission by three source

3.2 碳酸鹽溶解對土壤釋放CO2的貢獻

通過對全球23篇關于SIC釋放的文獻整合分析，發現SIC溶解對土壤總碳（SIC+SOC）釋放的貢獻在3%～95%之間，平均值為46%，95%置信區間分布為37%～55%（表3），與本研究的結果接近，即在整個玉米旺盛生長階段（從拔節到生育期末）， SIC源CO2占土壤源CO2的比例為40%（圖6），這就說明SIC溶解對穩定全球碳庫和調節CO2濃度方面非常重要[27]，然而，以往研究較少考慮SIC溶解對CO2排放的貢獻，這將導致SOC分解的高估，影響SOC激發效應的定量[8-9，28]。

表3 碳酸鹽溶解對土壤CO2釋放的貢獻比較 Table 3 Contribution of carbonate dissolution to soil CO2 emission

隨著我國農業集約化水平不斷提高，銨態氮肥和尿素用量也不斷增加，通過硝化作用產生H+，影響的弱酸平衡體系，屬于強酸與碳酸鹽的直接反應，加劇碳酸鹽的溶解[37-39，50]。因此，今后有必要量化氮肥投入對華北農田SIC溶解的影響，提高區域石灰性農田土壤碳預算的準確性。

石灰性土壤中存在著CO2（氣相）-HCO-3（液相）-CaCO3（固相）的三相平衡，SOC分解、根源呼吸與SIC溶解/沉淀平衡之間存在耦合關系，體現在SOC分解和根源呼吸產生的CO2，既可以驅動碳酸鹽的溶解與釋放，也可以與鈣、鎂離子結合形成次生性碳酸鹽[3-4，7]：

本研究中，根源呼吸占根際土壤CO2的貢獻比例為50%。玉米生長增加土壤中CO2分壓，可能加劇SIC的溶解與釋放。此外，根系生長也可以分泌質子和有機酸，促進SIC的溶解[13，51]。因此，玉米根際效應對SIC溶解的影響是不可忽視的。

3.3 玉米生長對土壤碳平衡的影響

盡管作物生長可以產生正根際效應，促進SOC分解和SIC溶解，但引發正根際效應的植物來源的有機碳（根際沉積碳和根系）并未被微生物完全分解釋放到大氣中，殘留部分可以補充因根際效應引起的SOC和SIC損失[52]，在本研究中土壤碳收支平衡表現為碳匯。在石灰性土壤，作物生長不僅可以貢獻SOC的截存[15，53-54]，還可以貢獻SIC的次生形成[55]，但由于土壤SIC背景太大和13C檢測限（約為10–7mol）較高，本研究在SIC中沒有檢測到標記的13C信號[15]，今后可以考慮用檢測限更加敏感的14C（約為10–13mol）來解決[55-56]。

4 結 論

對于石灰性土壤，從玉米拔節期到生育期末，根源呼吸和土壤總碳（SIC+SOC）釋放對根際土壤CO2釋放的貢獻比值為1∶1，SIC溶解對土壤源釋放CO2的貢獻比例約為40%，說明SIC溶解對于土壤碳庫穩定和大氣CO2濃度調節具有雙重作用。若忽視SIC溶解對土壤CO2釋放的貢獻，有可能導致對SOC分解的高估，進而影響土壤碳平衡的評估。從拔節期到生育期末，玉米生長對地下部的光合碳輸入（根系+根際沉積物）超過土壤總碳（SIC+SOC）釋放的損失，土壤表現為碳匯。