籽粒鎘低積累水稻地上部鎘高積累遺傳特性分析

楊安琪,余海英,黃化剛,張錫洲,李廷軒

四川農業大學資源學院,成都 611130

鎘(Cd)是一種毒性極強的重金屬元素,其生物有效性高、遷移性強[1]。隨著工業化和城鎮化進程的加快,農田土壤Cd污染日益嚴重,且易隨食物鏈進入人體、危害人類健康[2-3]。水稻是人類膳食Cd的主要來源,其平均Cd含量顯著高于其他谷類食物[4]。因此,安全利用Cd污染農田土壤、降低糙米Cd含量成為亟待解決的糧食安全問題。選育籽粒Cd低積累水稻能保障Cd污染農田的安全生產,同時一些生物量大、地上部Cd積累能力較強的水稻品種表現出較好的Cd修復潛力[5-6],因而選育地上部Cd高積累、籽粒Cd低積累的水稻品種利于實現Cd污染農田的修復和安全生產。明晰水稻Cd積累的遺傳機制是選育籽粒Cd低積累或地上部Cd高積累水稻的重要前提。不同水稻品種Cd積累存在明顯的基因型差異,利于尋找相關功能基因[7-8]。研究發現,水稻Cd積累相關性狀屬數量性狀,遺傳機制復雜,同時受環境因素影響,因此不能僅通過表型對基因型進行選擇[9]。QTL定位通過建立數量性狀表型值與DNA分子標記間的關系,可以確定各個QTL位點在染色體上的位置、效應及其相關作用[10-11],使復雜數量性狀的遺傳改良和分子操縱成為可能,具有較大的應用前景[12-13]。近年來,利用Cd積累能力差異顯著的水稻品種構建的F2、RIL、CSSLs等群體進行QTL定位,在水稻12條染色體上發現了控制水稻籽粒和地上部Cd積累相關的QTLs[14-16]。Xue等[17]利用DH群體,在第7號染色體上得到控制地上部Cd含量的QTLqCDS7。Ueno等[18]和Tezuka等[19]利用不同親本構建的F2群體,也在第7號染色體上得到控制地上部Cd積累量的QTL,其中QTLqCdT7包含的基因OsHMA3發生堿基突變,以該基因作為分子標記,篩選出了Cd污染農田修復效果顯著的水稻品種Akita 110[19-22]。除第7號染色體外,Ueno等[18]和Yan等[23]分別還在第2、5、11和10號染色體上定位到控制水稻地上部Cd積累量的QTL。此外,還有研究發現水稻Cd積累相關QTL如qCd-2、qCd-7、GCC7、qCd1-3、CAL1等影響籽粒、葉片、根等部位Cd含量[14-15,24-25]。可見,通過QTL定位挖掘水稻Cd積累的關鍵基因有助于闡明水稻Cd積累的遺傳機制,為利用分子標記輔助選擇育種奠定基礎。相同土壤環境條件下,相較于其他籽粒Cd低積累水稻品種,雅恢2816具有更強的地上部Cd積累能力,可用于Cd污染農田邊修復邊生產。前期已對其籽粒Cd低積累特性進行了探討[26-28],但其地上部Cd積累的遺傳穩定性和遺傳機制尚不清楚。利用雅恢2816雜交后代F1和F2,分析其地上部Cd積累相關性狀的雜種優勢,挖掘控制地上部Cd積累相關性狀的QTL,明確其地上部Cd積累機制,為分子標記輔助選擇籽粒Cd低積累且地上部Cd高積累材料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻雅恢2816(R)、瀘98A(S1)、5406A(S2)、C268A(S3)、瀘98A/雅恢2816(H1)、5406A/雅恢2816(H2)、C268A/雅恢2816(H3)、F1群體(包含雅恢2816與3個不育系材料(瀘98A、5406A、C268A)分別雜交得到的第一代群體H1、H2和H3)、F2群體(共120個株系,為雜交組合H3的自交后代)。由四川農業大學農學院提供。雅恢2816是四川省常用雜交生產的秈稻品種,具有地上部Cd高積累和籽粒Cd低積累特性；瀘98A(S1)、5406A(S2)和C268A(S3)均為不育系水稻材料,其地上部Cd含量與積累量在盆栽和大田試驗中均顯著低于雅恢2816[26,28]。

1.2 試驗設計與處理

第一期試驗共設21個試驗小區(1 m×2 m),種植親本及F1,每個材料設3次重復。第二期試驗共設6個試驗小區和1個試驗大區(1 m×4 m),分別種植親本(雅恢2816、C268A)和F2。各小區隨機區組排列,各區間設20 cm緩沖帶。每小區種植水稻32穴,每大區種植水稻120穴,每穴1株,株行距為20 cm×25 cm。三葉期栽插,采用旱地育秧,于當年4月播種,5月移栽,按當地習慣進行水肥管理和病蟲害防治。

試驗區位于四川省成都平原某市的Cd污染農田,屬中緯度亞熱帶濕潤氣候區,海拔507 m,年均溫15.9—16.1 ℃,年均降水量900—1000 mm。試驗土壤基本理化性質為pH 6.60、有機質34.61 g/kg、全氮2.43 g/kg、堿解氮100.31 mg/kg、有效磷19.03 mg/kg、速效鉀69.25 mg/kg、全Cd 1.92 mg/kg、有效Cd 0.63 mg/kg。

1.3 樣品采集與制備

于水稻抽穗期,分單株采集雅恢2816、C268A和F2幼葉鮮樣于2mL滅菌滅酶凍存管中,經液氮冷凍后儲存于-75℃超低溫冰箱中,用于DNA提取。于水稻成熟期采樣,將樣品用自來水沖洗干凈,根部用20 mmol/L Na2-EDTA溶液浸泡15 min去除根表附著的Cd2+,再用去離子水洗凈,最后用吸水紙擦干。將植株分為根、莖、葉、穗,根、莖、葉于105 ℃下殺青30 min后,75 ℃烘干至恒重,稱重后粉碎備用,穗部經風干稱重后,脫粒制成糙米備用。

1.4 測定項目及方法

土壤基本理化性質采用常規分析方法[29]；土壤全Cd含量采用HNO3-HClO4-HF(5∶1∶1,體積分數)消化,有效態Cd含量采用DTPA提取,植株Cd含量采用HNO3-HClO4(5∶1,體積分數)消化,火焰原子吸收分光光度計(AA400P,Analytikjena,Germany)測定。

1.5 基因型分析

采用Takara試劑盒提取葉片DNA。利用簡化基因組測序技術(Genotyping by sequencing)進行基因型鑒定。內切酶組合為EcorI/NIaIII(New England Biolabs,Ipswich,MA)。

1.6 QTL定位

利用已構建的遺傳連鎖圖譜和表型數據[27],采用WinQTL Cartographer v2.5 程序包的復合區間作圖法(Composite Interval Mapping,CIM)進行QTL定位分析。選擇0.5 cM的掃描區間,在整個遺傳圖譜上逐步掃描尋找QTL。同時,選擇距離待檢測區間至少10 cM,與性狀相關性顯著性最強的前15個標記作為協變量,校正背景QTL效應對目標區間QTL分析的影響。以LOD值2.5作為閾值來判斷QTL是否存在,若標記區間中LOD>2.5,則認為該區間LOD最高處所對應的位點為一個QTL,并估計各個QTL對表型變異的貢獻率。QTL的命名基本按照McCouch等[30]的方法并稍作改動：q+目標性狀英文縮寫名稱(首字母大寫)+“-”+連鎖群的序號+“-”+同一連鎖群上QTL數,本文中QTL名稱均用斜體表示。qSB指控制指地上部生物量的QTL；qSCdA指控制指地上部Cd積累量的QTL。

1.7 數據處理

地上部Cd積累量=莖生物量×莖Cd含量+葉生物量×葉Cd含量,超親優勢=(F1表型值-高值親本表型值)/高值親本表型值×100%,中親優勢=(F1表型值-雙親表型平均值)/雙親平均值×100%。

統計分析在SPSS 24.0中進行,多重比較選擇LSD法；圖表制作采用Origin 8.0和Excel 2013。

2 結果與分析

2.1 F1地上部Cd積累相關性狀的雜種優勢

親本及其F1地上部生物量、Cd含量和Cd積累量差異顯著(表1,表2)。總體而言,F1地上部生物量顯著高于雅恢2816,除H2,雜交組合H1和H3與其不育系母本無顯著差別。H1、H2和H3地上部生物量分別為雅恢2816的1.43、1.35和1.43倍。所有雜交組合地上部Cd含量顯著低于雅恢2816,顯著高于不育系母本。所有雜交組合地上部Cd積累量顯著高于各不育系母本,與雅恢2816無顯著差別。H1、H2和H3地上部Cd積累量分別為雅恢2816的1.17、1.16和1.16倍。F1地上部Cd積累相關性狀表現出較好的中/超親優勢,Cd積累相關性狀雜種優勢受遺傳效應的影響,C268A/雅恢2816后代表現較好,可利用其F2進行遺傳特性分析。

表1 親本及其F1地上部Cd積累相關性狀Table 1 Comparison of differences of traits related to shoot Cd accumulation between rice parents and their F1 hybrids

表2 F1地上部Cd積累相關性狀的中/超親優勢Table 2 Mid-/Super-parent heterosis of traits related to shoot Cd accumulation in F1 hybrids

2.2 F2地上部Cd積累相關性狀的遺傳特性分析

雅恢2816地上部Cd含量、Cd積累量顯著高于C268A,生物量無顯著差異(表3)。雅恢2816地上部Cd含量和Cd積累量分別為C268A的2.17和2.03倍。F2地上部生物量、Cd含量和Cd積累量表現為連續分布和中/超親分離,變異系數分別為51.14%、15.18%和57.79%,其中Cd積累量變異較大。說明地上部Cd積累相關性狀均為數量性狀,適合進行QTL定位。

表3 親本與F2地上部Cd積累相關性狀的表型變異Table 3 Phenotypic variation of traits related to shoot Cd accumulation in rice parents and F2 population

對F2地上部Cd積累量與各性狀間進行相關性分析(表4),除根和糙米Cd含量外,地上部Cd積累量與地上部生物量、Cd含量,根、糙米的生物量、Cd積累量和根-地上部轉移系數呈極顯著正相關,與地上部-籽粒轉移系數呈極顯著負相關。說明水稻地上部Cd積累量與地上部生物量、Cd含量,根、糙米的生物量、Cd積累量和根-地上部轉移系數、變化趨勢相同,而與根-地上部轉移系數變化趨勢相反。

表4 F2地上部Cd積累量與各器官Cd積累相關性狀之間的相關性分析Table 4 Correlation analysis between shoot Cd accumulation and traits related to organs Cd accumulation in F2 population

2.3 F2地上部Cd積累相關性狀QTL定位

利用C268A與雅恢2816構建的F2作圖群體,共定位到4個與地上部生物量和Cd積累量緊密連鎖的主效QTL位點(表5,圖1)。其中,地上部生物量緊密連鎖的QTLqSB-6位于第6號染色體,物理區間大小為4.28cM,表型貢獻率為14.4%。3個控制地上部Cd積累量的QTLqSCdA-4、qSCdA-6-1和qSCdA-6-2分別位于第4、6和6號染色體,其物理區間大小分別是9.64、13.5和2.43cM,表型貢獻率分別為11.7%、14.4%和10.6%。4個QTL的加性效應均為負,表明控制增加地上部生物量及Cd積累量的基因均來自父本雅恢2816。在第6號染色體上,區間marker04171-marker04197同時控制地上部生物量與Cd積累量,其物理區間大小為3.28cM。

表5 F2地上部Cd積累相關性狀QTL定位Table 5 QTL mapping of traits related to shoot Cd accumulation in F2 population

圖1 F2地上部Cd積累相關性狀QTL的染色體定位Fig.1 Chromosome location of QTL related to shoot Cd accumulation in F2 populationQTL qT-r-s-6-2、qGB-4和qRCdA-6來源于前期研究結果[27,31]

3 討論

3.1 水稻地上部Cd積累的雜種優勢及遺傳機理

Cd脅迫下,植物的正常生長發育會受到影響,首先體現在根、莖、葉生物量的變化[32]。本研究中,雜交組合瀘98A/雅恢2816、5406A/雅恢2816和C268A/雅恢2816的地上部生物量顯著高于父本雅恢2816,表現出中/超親優勢,表明利用雜交育種,可以明顯提高水稻的生物量。同時,各雜交組合地上部Cd含量和Cd積累量顯著高于不育系母本,表現出中/超親優勢。前期發現,在Cd污染大田和不同Cd處理的盆栽試驗中,各雜交組合籽粒Cd含量顯著低于雙親,表現出明顯的負向超親優勢[31,33]。研究表明,雜交水稻對Cd的積累主要受雙親遺傳背景影響[34]。雅恢2816具有籽粒Cd低積累、地上部Cd高積累特性,可穩定遺傳給后代。因此,以上雜交組合可應用于Cd污染農田的邊生產邊修復。具有雜種優勢的性狀一般屬數量性狀,受多基因控制,親本材料的遺傳背景差異可能導致雜交組合Cd積累量存在較大差異[34-35],從分子層面深入挖掘水稻Cd積累的遺傳機制可提高雜種優勢利用效率。本研究利用地上部Cd積累特性差異顯著的親本材料,在第4和6號染色體上得到控制地上部Cd積累量的QTLqSCdA-4、qSCdA-6-1和qSCdA-6-2,與前人結果比較,是新的控制水稻地上部Cd積累量的主效QTL。

3.2 水稻Cd積累相關性狀遺傳關系分析

了解水稻地上部與籽粒Cd積累的遺傳關系對于實現Cd污染農田邊生產邊修復目標至關重要。Wang等[36]利用RIL群體,在7號染色體上定位到同時控制水稻地上部Cd含量和糙米Cd含量的QTLqCd7.1。Ishikawa等[37]利用BILs群體,在第2號染色體上控制籽粒Cd含量的QTLqGCd2與控制地上部Cd含量的QTLqSCd2緊密連鎖,在第7號染色體上控制籽粒Cd含量QTLqGCd7和地上部Cd含量的QTLqSCd7完全重疊。Hu等[38]與Abe等[39]在3號染色體上分別定位到控制糙米Cd含量的QTLqCCBR3和控制地上部Cd含量的QTLqlGCd3,二者存在重疊區域。Ueno等[18]和Liu等[15]利用不同的作圖群體,以水稻地上部Cd積累量與糙米Cd含量為指標進行QTL定位,在第2號染色體上,兩個QTL存在重疊部分。本研究中控制水稻地上部Cd積累量的QTL與前期得到的4個控制糙米Cd含量的QTL位點位于不同的染色體[27],與Wang等[36]和Ishikawa等[37]的研究結果不同,且與其他學者比較,也并無重疊區域,與Hu等[38]和Abe等[39]、Ueno等[18]和Liu等[15]結果不同。這可能與不同研究的雙親遺傳差異和群體類型不同有關[40]。本研究中,控制糙米Cd含量和地上部Cd積累量的QTL增效等位基因來源不同,且定位于不同染色體,表明源于雅恢2816的等位基因不會同時增加地上部Cd積累量和糙米Cd含量。

水稻地上部Cd積累量與各器官生物量、Cd積累量、轉移系數之間存在明顯的相關性,且在4號和6號染色體出現QTL集簇區Cl4-1、Cl6-1、Cl6-2和Cl6-3。在4號染色體上,集簇區Cl4-1發生qGB-4與qSCdA-4重疊,且加性效應一致[31],表明Cl4-1能增加地上部Cd積累量并提高稻米產量。經基因預測,在集簇區Cl4-1內含有基因Os04g0613000(OsZIP3)。研究發現,OsZIP3在水稻節點表達較高,負責擴大維管束的木質部中Zn的卸載,從而調控Zn在地上部的分配[41]。Cd和Zn具有相似的化學性質,一些Zn轉運蛋白同時負責Cd的轉運[42],因而推測OsZIP3可能參與了Cd的分配,進一步研究Os04g0613000的功能,有助于解釋雅恢2816地上部Cd積累機制。親本雅恢2816具有較高的根-地上部轉移系數,且地上部-籽粒轉移系數較低,使其具有籽粒Cd低積累、地上部Cd高積累特性。相關研究表明,OsHMA2和OsHMA3在Cd從根向地上部的轉運過程中起到重要作用,OsHMA2參與Cd向木質部的裝載[43],而OsHMA3能將Cd區隔化在根細胞的液泡中[20,44]。但在本研究中同時控制根-地上部轉移和地上部Cd積累量的集簇區Cl6-1不包含OsHMA2和OsHMA3,有望在集簇區Cl6-1挖掘到類似功能的新基因。集簇區Cl6-2發生qSCdA-6-1、qSB-6、qRCdA-6重疊,Cl6-3 發生qSCdA-6-1、qRCdA-6重疊[31],F2地上部Cd積累量與地上部生物量、根Cd積累量呈極顯著正相關,可見增加地上部生物量和根系Cd積累量,能有效提高水稻對Cd的提取效率。控制數量性狀的QTL在染色體上成簇分布的現象可見于絕大多數研究中,這可能是同一基因控制不同性狀的表達,也可能是控制多個性狀表達的基因緊密連鎖的結果[39,45],后續可針對重疊區段進行深入研究,以期挖掘控制地上部Cd積累的關鍵基因。

4 結論

籽粒Cd低積累親本材料雅恢2816具有地上部Cd高積累特性,且能穩定遺傳。地上部Cd積累相關性狀由多基因控制,F2代中/超親優勢明顯。QTLqSB-6控制地上部生物量,QTLqSCdA-4、qSCdA-6-1和qSCdA-6-2控制地上部Cd積累量。區間marker04171-marker04197同時關聯著水稻地上部生物量(qSB-6)與地上部Cd積累量(qSCdA-6-1),且與控制籽粒Cd含量的QTL未發生重疊,該區間為后期利用分子標記輔助育種同時實現籽粒Cd低積累、地上部Cd高積累提供可能。