聚乙二醇接枝苯乙烯馬來酸共聚物復合微球的制備和檢測應用

張賢楠，冷遠逵，武衛杰，李萬萬

(上海交通大學 金屬基復合材料國家重點實驗室，上海 200240)

隨著現代醫藥學的發展，個人基因圖譜、臨床診斷和藥物研發等應用領域均需要對大量生物分子進行快速定性和定量的分析檢測[1].因此，多元檢測技術，如固態陣列式芯片[2]和液相懸浮式生物芯片技術發展迅速.其中，以懸浮編碼微球為反應載體的液相生物芯片技術因兼具快速高通量、高密度多元分析、高靈敏度和應用范圍廣泛等優勢而備受關注[3-4].在多元檢測中存在非特異性吸附(交叉反應性)[5]，尤其在蛋白的免疫檢測中，捕獲探針、檢測抗體和非特異性抗原等物質之間的交叉反應會導致背景熒光增強，活性位點可能被非特異性吸附的蛋白占據而降低檢測靈敏度，從而限制同時檢測的蛋白種類.在基于聚合物微球的液相生物芯片中，由于微球比表面積大，所以非特異性吸附現象更易產生[6].對此，抑制或降低非特異性吸附對于提高液相生物芯片的靈敏度和多元檢測能力至關重要.

目前，抑制非特異性吸附的常見方法為在微球表面修飾非特異性吸附抑制劑.抗非特異性吸附常用材料主要為天然蛋白，如牛血清白蛋白(BSA).BSA的空間位阻作用能夠有效降低非特異性吸附[7]，然而其抑制效果不穩定，且存在生物污染的可能性.因此，人工合成的親水性聚合物作為非特異性吸附抑制劑得到發展.其中，聚乙二醇(PEG)及其衍生物最具代表性[8-9].PEG同時具有水合作用和空間排斥效應，因此經PEG修飾的基體具有優異的抗非特異性吸附能力.Sarma等[10]用等物質的量的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷和2-[甲氧基(聚氧乙烯)6-9丙基]三甲氧基硅烷對聚苯乙烯/二氧化硅核殼結構微米球進行表面官能化，使微球表面具有氨基和聚乙二醇硅烷(PEGS)鏈.在針對咖啡因的免疫檢測中，其有效抑制了抗體的非特異性結合.然而將PEG化學偶聯在微球表面的制備工藝復雜，成本高，不適合大量制備.因此，需要發展簡單、低成本和高產率的PEG接枝聚合物微球的制備方法.

在合成具有不同PEG接枝率和鏈長的聚乙二醇接枝苯乙烯馬來酸共聚物(PEG-g-PSMA)的基礎上，本文結合SPG膜乳化-乳液溶劑揮發法制備系列銅銦硫/硫化鋅(CuInS2/ZnS)量子點復合PEG-g-PSMA熒光微球.該方法的制備工藝簡單、可重復性高，且所制備的PEG-g-PSMA復合微球具有優異的單分散性和熒光性能，適用于在干擾物甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)存在的條件下，腫瘤標志物糖類抗原CA199的免疫檢測.以PSMA復合微球作對照，研究PEG-g-PSMA復合微球在免疫檢測中抑制非特異性吸附和提高檢測靈敏度的效果與PEG接枝率和鏈長之間的相關規律.研究結果有助于推動液相芯片技術的廣泛應用.

1 實驗方法

1.1 PEG-g-PSMA合成

PEG-g-PSMA的合成分兩步進行.第一步為苯乙烯馬來酸酐共聚物(PSMAH，Sigma-Aldrich，美國)的水解.將4 g PSMAH加入50 mL四氫呋喃中，磁力攪拌至完全溶解；逐滴加入0.5 mL、質量分數為36.5%的濃鹽酸，于55 ℃加熱回流12 h，加入去離子水使聚合物沉淀；將沉淀物用大量的去離子水洗滌3次并凍干，即可得到苯乙烯馬來酸共聚物(PSMA).第二步為甲氧基聚乙二醇(mPEG，阿拉丁，中國)和PSMA的酯化接枝反應.將0.5 g PSMA、若干一定相對分子質量的mPEG和20 μL三乙胺加入 30 mL 甲苯中，磁力攪拌至完全溶解；在氮氣(N2)氛圍中于90 ℃加熱回流12 h，冷卻至室溫，加入無水乙醚使聚合物沉淀；將沉淀物用大量無水乙醚洗滌3次并凍干，即得到PEG-g-PSMA.

1.2 量子點/PEG-g-PSMA復合微球制備

利用SPG(一種多孔玻璃膜)膜乳化-乳液溶劑揮發法[11]制備量子點/PEG-g-PSMA復合微球.取0.12 g PEG-g-PSMA和10 mg CuInS2/ZnS量子點(自制)溶于4 mL二氯甲烷中，該溶液作為分散相；取1 g十二烷基硫酸鈉(SDS)溶于200 mL超純水中，該溶液作為連續相.在3 kPa氮氣壓力下，外壓式MG-20膜乳化裝置儲液罐中的分散相透過SPG親水膜上的微孔(孔徑4.9 μm)被擠入流動的連續相中，并形成均一的水包油(O/W)型乳液.在室溫條件下，對乳液以 2 200 rad/min的速度磁力攪拌24 h，液滴固化得到微球懸浮液；將微球用超純水和無水乙醇各離心洗滌3次并凍干，即得到量子點/PEG-g-PSMA復合微球，制備過程如圖1所示.將分散相中的PEG-g-PSMA改為PSMA，即可制得量子點/PSMA復合微球.通過調節分散相中量子點的發射波長λ=695，755，790 nm，可以得到3種熒光編碼.

1—壓力表；2—進氣閥；3—分散相儲液罐；4—排氣閥；5—連續相；6—SPG親水膜；7—磁力攪拌器

1.3 腫瘤標志物免疫檢測

根據表1配方配制免疫檢測實驗用緩沖液.其中，磷酸鹽緩沖液(PBS)和微球活化液以超純水為溶劑配制，微球洗滌液、1#和2#儲存液以及1#和2#分析液以PBS為溶劑配制.

表1 免疫實驗緩沖液配方

采用液相生物芯片對CA199進行免疫檢測.首先，利用復合微球表面的羧基和抗體探針的氨基之間的酰胺化反應，將抗體探針偶聯在微球表面.懸浮在樣品溶液中的帶有特定抗體探針的微球可以捕獲樣品內的目標抗原分子.然后加入由生物素標記的檢測抗體和由親和素標記的熒光報告分子藻紅蛋白SA-PE，最后在微球表面形成“三明治”型雙抗夾心免疫檢測結構[12].利用流式細胞儀檢測微球的熒光信號，根據微球的量子點熒光編碼信號和報告分子藻紅蛋白(PE)的熒光強度即可定量分析待測樣品中目標抗原的質量濃度或活性濃度.本文將已知活性濃度的抗原標準品作為待測物，經梯度稀釋后檢測并繪制標準曲線.

1.3.1復合微球的表面探針包被 取2×105個量子點/PEG-g-PSMA復合微球或量子點/PSMA復合微球于離心管中，用微球洗滌液離心洗滌3次.加入100 μL微球活化液，超聲并渦旋至微球分散均勻，加入10 μL、50 mg/mL新制的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基硫代琥珀酰亞胺溶液(Sigma-Aldrich，美國)，于室溫以 8 800 rad/min振蕩避光孵育20 min，用PBS離心洗滌.將微球重新分散于500 μL PBS中，加入12 μg CA199捕獲抗體作為探針，于10 ℃以 8 800 rad/min振蕩避光孵育12 h，用微球洗滌液離心洗滌.加入500 μL 2#分析液，于室溫以 8 800 rad/min振蕩避光孵育30 min，離心洗滌后將包被好探針的微球分散于儲存液中，置于冰箱4 ℃避光保存.

1.3.2含AFP和CEA干擾的CA199單因子免疫檢測 將CA199抗原標準品梯度稀釋，配制活性濃度為0、0.1、1、10、100、1 000 kU/L(1 U=1 μmol/min)的CA199抗原溶液.將偶聯了CA199捕獲抗體的復合微球以2×104個/孔的投量加入96孔板中，用微球洗滌液抽濾洗滌3次；每孔均加入100 μL、100 ng/mL的AFP和CEA抗原溶液以及不同活性濃度的CA199抗原溶液，于室溫以 6 900 rad/min振蕩避光孵育1 h，抽濾洗滌3次.向各孔加入 100 μL、5 μg/mL生物素標記的AFP、CEA和CA199檢測抗體溶液，于室溫以 6 900 rad/min振蕩避光孵育1 h，抽濾洗滌3次.向各孔加入100 μL、1 μg/mL 的SA-PE溶液(Invitrogen，美國)，于室溫以 3 200 rad/min振蕩避光孵育10 min，抽濾洗滌3次.最后，每孔加入200 μL微球洗滌液以分散微球，并將微球懸浮液轉移至離心管，采用流式細胞儀(FC500，美國Beckman公司)進行檢測，激發光源為488 nm氬離子激光器，微球的編碼信號由通道FL4和FL5檢測，PE的定量信號由通道FL2檢測.通道FL2、FL4和FL5的熒光采集范圍分別為(575±15)nm、(675±15)nm和(755±15)nm.

2 結果與分析

2.1 PEG-g-PSMA的合成與表征

PEG-g-PSMA的合成路線如圖2所示.首先，PSMAH的酸酐基團在酸性條件下進行水解得到PSMA；然后，經三乙胺催化，PSMA和mPEG在甲苯中酯化接枝得到PEG-g-PSMA.PEG-g-PSMA的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和核磁共振氫譜(1H NMR)見圖3.其中，σ為波數，δ為化學位移.圖3(a)中，在σ=3 026，1 601，1 493，1 453，1 076，1 030，758，699 cm-1處是苯環特征峰；在σ=2 925，2 851 cm-1處是苯乙烯單元上亞甲基的伸縮振動吸收峰.水解后，在σ=1 856，1 780，1 219 cm-1處的五元環酸酐(C==O)—O—(C==O)的伸縮振動吸收峰明顯變弱，在σ=1 710 cm-1處出現羧基中 C==O 雙鍵的伸縮振動吸收峰，在σ=3 455 cm-1處出現寬而強的羧基中O—H單鍵的伸縮振動吸收峰，表明PSMAH已轉化為PSMA.此外，在σ=1 735 cm-1處出現酯基中C==O雙鍵特征峰，在σ=1 106 cm-1處出現 C—O—C 鍵的伸縮振動吸收峰，表明mPEG已接枝到PSMA上.圖3(b)中，在δ=6.5×10-6，7.1×10-6處為苯乙烯單元上苯基質子的吸收峰，在δ=3.5×10-6處為PEG亞甲基質子的吸收峰，表明PEG-g-PSMA成功合成.

圖2 PEG-g-PSMA合成圖

圖3 PEG-g-PSMA表征

對1H NMR譜圖中的峰面積積分，由下式計算得到每個PSMA分子上接枝的PEG分子數，即PEG接枝率：

其中：na為相對分子質量 224 000、酸酐質量分數7%的PSMAH中苯基質子數，取 10 015；nb為mPEG中亞甲基質子數，與PEG相對分子質量有關；Aa為苯基質子吸收峰面積；Ab為PEG亞甲基質子吸收峰面積.以PSMA與PEG1000投料質量之比，即m(PSMA)/m(PEG1000)=1合成的接枝聚合物PEG1000-g-PSMA為例，1H NMR譜峰面積比Aa/Ab=3.7，當PEG相對分子質量為 1 000 時，nb=88，則PEG1000-g-PSMA的PEG接枝率平均約為31.不同投料比所得PEG1000-g-PSMA的PEG接枝率如圖4所示.由圖可知，在一定范圍內，隨著m(mPEG)/m(PSMA)的增大，PEG接枝率呈線性增長趨勢，說明通過調節mPEG的投料量可以控制接枝率.

圖4 PEG接枝率與投料比關系圖

通過調節投料比和PEG相對分子質量制備一系列具有不同PEG接枝率和PEG鏈長的接枝聚合物，如表2所示.其命名通式為xPEGy-g-PSMA，其中x為PEG接枝率取5的整數倍，y為PEG相對分子質量.

表2 不同PEG接枝率和鏈長的接枝聚合物

2.2 量子點/PEG-g-PSMA復合微球的形貌與性能

利用表2中的PEG接枝聚合物，以膜乳化-乳液溶劑揮發法制備量子點/PEG-g-PSMA復合微球.λ=695 nm的CuInS2/ZnS量子點復合30PEG1000-g-PSMA熒光微球的掃描電子顯微鏡(SEM)照片和激光掃描共聚焦(CLSM)層掃照片如圖5所示.由圖5(a)可知，微球呈規則球形且表面光滑，單分散性和均一性良好.經粒徑統計，不同接枝率和相對分子質量聚合物制備的復合微球的平均粒徑均在4.9～5.3 μm范圍內，粒徑變異系數均在8%～10%范圍內.在制備過程中，聚合法等制備方法易導致量子點在微球內部形成局部團聚[13]，增大不同量子點之間的共振能量轉移，從而影響量子點的編碼能力[14].由圖5(b)可知，由膜乳化-乳液溶劑揮發法制備的微球，其內部不同水平橫截面的量子點分布均勻，微球可發射出強烈的紅色熒光.結果表明，PEG接枝聚合物具有良好的乳化成球性能.

圖5 695 nm熒光30PEG1000-g-PSMA復合微球形貌分析

分別利用λ=695，755，790 nm的CuInS2/ZnS量子點和30PEG1000-g-PSMA聚合物制備出3種熒光編碼微球，依次命名為30PEG1000-695、30PEG1000-755和30PEG1000-790.圖6為3種微球在流式細胞儀FL4和FL5通道熒光強度散點圖上形成的含有3個編碼的熒光編碼矩陣.其中，I為強度.由圖6可知，具有相同熒光編碼的微球在散點圖中集聚為1個編碼團簇，不同位置的團簇代表不同的熒光編碼，且編碼團簇內各點緊密集聚，表明復合微球可以進一步應用于液相芯片熒光編碼多元檢測.

圖6 流式細胞儀編碼矩陣

2.3 量子點/PEG-g-PSMA復合微球用于CA199檢測

血清中糖類抗原CA199的活性濃度檢測對胰腺癌、結直腸癌的診斷和治療至關重要.在液相芯片免疫檢測中，為了評估量子點/PEG-g-PSMA復合微球在降低非特異性吸附、提高檢測靈敏度方面的可行性和效果，進行含AFP和CEA干擾的CA199單因子檢測試驗.在有較高質量濃度干擾物APF和CEA存在的條件下，對CA199進行檢測，并將量子點/PSMA復合微球的免疫檢測結果作為對照.根據緩沖溶液的不同，將每組免疫檢測試驗分為兩種類型：1#試驗中微球探針包被封閉液(1#分析液)和微球存儲液(1#存儲液)均含有BSA，即以BSA為非特異性吸附抑制劑的免疫試驗；2#試驗均使用不含BSA的緩沖液(2#分析液和2#存儲液)，即無非特異性吸附抑制劑的免疫試驗.根據兩組試驗的結果，比較PEG接枝和BSA對免疫檢測中非特異性反應的抑制效果.

利用不同PEG接枝率及其相對分子質量的復合微球分別進行1#試驗和2#試驗，檢測標準曲線，即平均熒光強度-CA199抗原活性濃度(IMF-c)曲線如圖7所示.由圖中的抗原低活性濃度區域放大圖可知，隨PEG接枝率或相對分子質量的增大，由非特異性吸附導致的背景熒光逐漸降低.當N≥30或y≥1 000 時，1#試驗和2#試驗的免疫檢測標準曲線基本重合，說明此時復合微球自身具有較好的抑制非特異性吸附的能力，繼續添加BSA則抑制效果不變.但是，隨PEG接枝率或相對分子質量的增大，由特異性免疫反應產生的定量檢測信號逐漸降低，這是因為PEG接枝和長鏈PEG的空間位阻效應使得微球表面有效羧基數目減少[15].

圖7 CA199單因子免疫檢測標準曲線

由檢測標準曲線估算出最低檢測限(LOD)值，如表3所示.由表可見，隨PEG接枝率和相對分子質量的增大，LOD值均先減小后增大.與PSMA復合微球相比，PEG接枝聚合物復合微球的檢測靈敏度明顯提升.其中，30PEG1000-g-PSMA微球的檢測靈敏度最高，LOD值為0.9 kU/L，優于以BSA為抑制劑的PSMA微球對照組.說明在免疫檢測中，量子點/PEG-g-PSMA復合微球自身具有良好的抑制非特異性吸附的能力，不需要再使用BSA等非特異性吸附抑制劑.而當PEG接枝率或相對分子質量增大至一定程度后，LOD值升高，這也是由微球表面羧基不足令檢測信號降低導致的.

表3 CA199單因子免疫檢測最低檢測限

3 結語

以PEG-g-PSMA為基體材料，利用膜乳化-乳液溶劑揮發法制備不同PEG接枝率和相對分子質量的CuInS2/ZnS量子點復合PEG-g-PSMA熒光微球.所制備的微球呈規則球形且單分散性良好，平均粒徑為4.9～5.3 μm，粒徑變異系數為8%～10%，內部量子點及其熒光分布均勻，并且可以通過調節mPEG的投料量和相對分子質量控制PEG-g-PSMA中PEG接枝率及其鏈長.在干擾分子存在條件下的CA199免疫檢測中，復合微球表現出抑制非特異性吸附的特性，且其抑制效果與PEG的接枝率和鏈長相關.與使用BSA相比，調節PEG的接枝率和鏈長可以獲得更高的檢測靈敏度.該基于PEG接枝聚合物微球的液相芯片體系具備抗干擾性、高靈敏度和準確高效等優點，令單個或多種物質的體外分析更加靈敏快捷，作為檢測載體的微球適合大量制備且制備工藝簡單.進一步完善基體聚合物的接枝率隨投料比和PEG相對分子質量的變化規律，有望實現在蛋白、核酸等體外指標檢測領域的臨床應用.