12種LncRNA對心力衰竭及其相關病因診斷價值的Meta分析

彭啟龍，林碧秀，譚 露，王 萍，邱漢波，黃修解

從全球疾病負擔著眼，心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)始終占人類疾病負擔的主要組成部分，是直接或間接的主要死因[1]。報告顯示，包含1 550萬例冠心病、心力衰竭病人在內的中國CVDs病人已達到2.9億例，且死亡率和患病率一直升高，居民因CVDs的致死率遠超腫瘤等其他疾病，占四分之一左右[2]。就中國疾病負擔而言，在各種CVDs進展過程失代償期的心力衰竭，被衛生行政部門列入亟待解決的清單中[3]，也是全球慢性CVDs防治的重要部分。近年來，有關心力衰竭發生機制已發展至基因水平研究，為臨床診治提供了新靶點和新思路[4]。此外，對心臟表觀遺傳學研究方法也日漸深入[5]。

被轉錄成RNA的在人類基因組DNA中占90%以上，其中具備蛋白質編碼能力的則僅占2%左右，而非編碼RNA(ncRNA)占絕大多數，ncRNA可分為環狀RNA、microRNA(miRNA或miRs)和其他小RNA(包括tRNA、5S和5.8S核糖體RNA、小核RNA和piRNA)、長鏈非編碼RNA(LncRNA)。轉錄本含有不少于200個核苷酸且自身不具備編碼蛋白功能的LncRNA占ncRNA類別的80%左右。在經歷從一代到高通量測序的歷程中，也逐漸擺脫了早期有關研究[6-9]認為LncRNA在轉錄中不起作用且是噪音的論斷，并揭示了LncRNA具有與mRNA趨同的展示調節轉錄、內含子外顯子剪接、組織特定環境中的表達方式等功能，還能通過與剪接因子相互作用改變mRNA剪接，通過染色質重塑蛋白實現調節表觀遺傳，促進或者阻斷轉錄因子影響基因表達水平等獨特功能[10-11]。有研究表明，LncRNA的差異表達與人類心血管疾病存在相關性，LncRNA參與調控心臟病理性肥大、血管疾病、動脈粥樣硬化、血脂異常等信號通路[12]。

有研究揭示了B型利鈉肽(BNP)與尿路上皮癌相關分子1(UCA1)結合診斷慢性心力衰竭(CHF)的準確性并未明顯增加。動物模型、臨床研究已證實LncRNA與心力衰竭疾病進展緊密相連[13]。精準化醫療時代在心力衰竭診斷、危險分層、治療等方面運用LncRNA具備極大價值[14-15]。人體內例如血液等體液中，LncRNA能以游離核酸形式檢測到，因其二級結構在該環境中相對穩定[16]。臨床上目前最常用于診斷心力衰竭的生物標志物有血漿N末端B型利鈉肽(NT-proBNP)、BNP、C反應蛋白(CRP)等[17]。但這些生物標志物在伴其他疾病時同樣升高，這使得早期心力衰竭未受到重視，而發展到失代償期后，才靠臨床癥狀去診斷[18]，因此，尋找敏感度(sensitivity，Sen)、特異度(specificity，Spe)更高、更早期的心力衰竭標志物顯得尤其重要。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 納入標準：①國內外開放的數據庫中已經發表的關于LncRNA對心力衰竭診斷價值的病例-對照研究；②研究主體為臨床確診為心力衰竭的病人；③評價指標包括Spe、Sen、綜合受試者工作特征(SROC)曲線下面積(AUC)和95%置信區間(CI)等；④未考慮年齡、性別和種族；⑤不考慮語言。排除標準：①原始研究未設置對照組；②試驗標本不是取自人類；③綜述、會議摘要等無試驗數據的文獻。

1.2 檢索策略 檢索PubMed、the Cochrane Library、EMbase、Ovid、中國知網、萬方、維普、CBMdisc中LncRNA診斷心力衰竭的文獻。由2名研究員分別進行檢索，按照其納入與排除標準，在閱讀文獻的題目、摘要時篩選，必要時則閱讀全文，意見有分歧時由第3名研究者進行判斷。對高質量文獻涉及文獻進行手工檢索。經文獻提供的網站補充材料信息、郵箱詢問索取資料的爭議文獻給予剔除。檢索方式如下：

以PubMed為例：

("Heart Failure"[MeSH]) AND "RNA，Long Noncoding"[MeSH]

以Cochrane Library為例：

'heart failure'：ab，ti AND LncRNA：ab，ti

以EMbase為例：

'heart failure'：ab，ti AND lncRNA：ab，ti

以Ovidsp Multi-Field Search為例：

(LncRNA and heart failure).ab.

以知網、萬方、維普、CBMdisc為例：

#1 心力衰竭

#2 心衰

#3 #1 or #2

#4 long non-coding RNA

#5 LncRNA

#6 #4 or #5

1.3 數據提取和質量評價 由2名研究人員獨立從納入文獻中提煉包含作者、文獻時間、樣本量、Spe、Sen、真陽性數(true positive，TP)、假陽性數(false positive，FP)、真陰性數(true negative，TN)和假陰性數(false negative，FN)、SROC AUC等評價數據。2名研究人員逐一參照QUADAS-2質量評價細則，進行文獻質量評估[19]。關于僅有ROC曲線和AUC值的文獻按照圖1進行數據挖掘，并通過文獻核對準確后納入。并按照表1進行數值計算[20-21]。

表1 診斷性試驗的四格表

圖1 根據ROC曲線、AUC數據挖掘流程圖

1.4 統計學處理 采用MetaDisc 1.4、Review Manager 5.3等統計學軟件，綜合分析LncRNA診斷心力衰竭的診斷效能。提取最終納入文獻的FP、TP、FN、TN，對Spe、Sen、診斷比值比(DOR)、PLR、NLR、AUC，經過數據匯總來驗證LncRNA的診斷價值，并繪制匯總后SROC曲線，提取SROC AUC及Q檢驗指數。采用χ2檢驗分析納入研究的異質性，I2用于檢驗異質性大小。當I2>50%或P<0.05，表明研究結果之間異質性較大，則應用隨機效應模型；當I2<50%或P>0.05，提示研究結果之間異質性較小，則采取固定效應模型。檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 文獻檢索及納入研究的基本特征、質量評價結果 利用布爾邏輯運算，共檢索到381篇相關文獻，采用EndNote軟件按納入與排除標準對標題、摘要、材料與方法學及全文逐步篩選，最終滿足Meta分析的有10篇文獻[22-31]，涉及12種LncRNA，包括UCA1、H19、LIPCAR、NRON、MHRT、CoroMarker、ENST00000507296、XIST、ENST00000532365、ENST00000504882、AF118081等。文獻檢索流程見圖2，納入文獻的一般情況見表2，文獻資料提取和軟件處理后數據匯總見表3，采用QUADAS-2質量評價對偏倚風險、文獻質量、適用性進行評價，詳見表4、圖3、圖4。

圖2 文獻篩選流程圖

表2 納入文獻基本信息

表3 納入文獻的數據匯總

表4 QUADAS-2 質量評價表

圖3 偏倚風險和適用性問題比例圖

圖4 偏倚風險和適用性問題偏倚風險總結

2.2 診斷性能分析

2.2.1 以心力衰竭為主要診斷的研究結果 共納入6篇文獻[22-23，27-29，31]，其中心力衰竭組443例，健康組269例。與健康組比較，LncRNA診斷心力衰竭的合并評價指標結果詳見表5。以心力衰竭為主要診斷的研究合并Spe、Sen、NLR、PLR、SROC AUC詳見圖5。

圖5 LncRNA預測以心力衰竭為主要診斷的研究結果(納入6篇文獻)

表5 按納入病人診斷分類的評價指標匯總表

2.2.2 以導致心力衰竭疾病為診斷的研究結果 以進展為心力衰竭相關疾病的病人為研究主體，納入4篇文獻[24-26，30]，其中可致心力衰竭疾病組共1 374例，對照組964例。LncRNA在導致心力衰竭疾病診斷效力比較時，合并評價指標值詳見表5。以可致心力衰竭的疾病為診斷的研究合并Spe、Sen、NLR、PLR、SROC AUC詳見圖6。

圖6 LncRNA預測以可致心力衰竭疾病為診斷的研究結果(納入4篇文獻)

2.2.3 LncRNA預測心力衰竭的總體分析結果 以LncRNA診斷心力衰竭及其誘因的文獻為研究主體，合計納入10篇[22-31]，其中心力衰竭及誘因組共1 817例，非疾病對照組1 233例。12項LncRNA在診斷心力衰竭及誘因時合并評價指標值詳見表5。10篇文獻的診斷性能合并Spe、Sen、NLR、PLR、SROC AUC詳見圖7。

圖7 LncRNA預測心力衰竭的診斷性能合并指標分析結果

3 討 論

多種原因引起的CVDs均將導致心肌結構、功能的代償，隨后導致心室泵血和/或充盈功能下降，最終會導致心力衰竭，LncRNA為診斷和預防心力衰竭開辟了新的領域[32]。

診斷心力衰竭目前臨床常用BNP聯合癥狀學檢查，在如肺栓塞、長期慢性阻塞性肺疾病(COPD)等其他疾病中同樣出現，這無疑讓心力衰竭的診斷更困難[33-34]。因而發現一個特異度、敏感度都好的生物標志物是十分必要的。現已有許多研究報道了LncRNA可作為一種新型的診斷心力衰竭的生物標志物，本研究采用Meta分析的方法評估LncRNA對代償期心力衰竭病人診斷的臨床價值。全面檢索數據庫后，發現暫時沒有發表有關LncRNA診斷心力衰竭的Meta分析，本研究以期為臨床提供循證醫學證據。

在胚胎發育期H19是高豐度表達的一組基因印記群，出生后明顯下調，最終轉錄為LncRNA H19和miRNA 675兩種。Greco等[35]研究表明LncRNA H19在非終末期心力衰竭病人、終末期心力衰竭病人、心肌肥厚小鼠模型中都明顯增加；Liu等[36]對心肌肥厚小鼠模型心肌組織檢測后發現LncRNA H19轉錄上調，并進一步驗證通過LncRNA H19轉錄軸涉及調節心肌細胞肥大，表明H19表達失衡可能促進缺血性心力衰竭的發展；LncRNA H19與脂質代謝相關[37]，這些都讓LncRNA H19成為預測心力衰竭危險分層提供可能。在心力衰竭小鼠模型中，經熒光定量測定心肌肥厚相關因子(CHRF)較無心力衰竭的小鼠對照組明顯表達，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法測得轉化生長因子-β1(TGF-β1)較對照組上升[38]。Greco等[39]研究揭示心力衰竭病人體內BACE1-AS、β淀粉酶表達明顯上升，經β淀粉酶處理后，人胚胎干細胞、小鼠胚胎干細胞生存力都下降，說明BACE1-AS、BACE1、β淀粉酶共同參與心力衰竭形成的病理機制。

目前，LncRNA應用于臨床檢測時還存在很多問題。首先，LncRNA的樣本制作和檢測耗時長，費用昂貴[40]；其次，RNA的檢測、制備都需要專業儀器設備，不同的檢測標本保存時間存在不一致性[41]。這些問題都是LncRNA的臨床實踐需要克服的；LncRNA的價值需要從檢測技術、臨床試驗等方面發展。

本研究的不足：匯總納入的文獻研究病例都是不連續的；5篇納入文獻[21-23，26，29-30]未記錄納入病例的時間間隔；10篇納入文獻研究的人群在分組前都已被診斷為心力衰竭組和對照組，未能回避病例-對照的研究設計；2篇文獻[21-22]未描述納入研究人群的診斷標準；所有納入的文獻研究LncRNA檢測前都未設定閾值，且檢測的時間未見明顯描述，這些因素給病例選擇、LncRNA的檢測、解釋帶來偏倚，影響歸一性結論的論證強度，若能在后續進行更高品質的臨床隨機對照試驗，并再評價LncRNA對心力衰竭的診斷性價值。

綜上所述，LncRNA對診斷代償期心力衰竭具備確切臨床價值，能幫助鑒別有其他疾病導致BNP等數值升高的心力衰竭病人，可與其他生物標志物共同檢測，指導臨床醫師更精確地診斷心力衰竭。