miR-146b-3p通過RAF1/p38MAPK/COX-2信號通路影響糖尿病發生腦梗死的機制研究

王 劍，王振煥，張欽昌

腦卒中是糖尿病病人動脈粥樣硬化性疾病的臨床表現[1-2]。腦梗死是臨床常見病，也是導致人類死亡的主要疾病[3-4]。目前，隨著人們生活質量的不斷提高，糖尿病引起的缺血性腦卒中病人在缺血性腦卒中病例中比例越來越高[5-6]。糖尿病合并急性腦梗死病人與非糖尿病合并急性腦梗死病人相比，臨床療效往往較差[7-8]。因此，對糖尿病伴有腦梗死(DMCI)病人進行更多關注和研究顯得尤為重要。近年來，白細胞介素-6(IL-6)、環氧化酶-2(cyclooxygenase，COX)與動脈血栓形成的關系引起人們越來越多的關注。人類miR-146是miRNA的一種，由22個核苷酸組成，它有兩種形式，分別為miR-146a和miR-146b。miR-146b位于人類的10號染色體(10q24.32)上[9-11]。Fulzele等[12]報道miR-146b-3p與炎癥和動脈血栓形成的進展和發展密切相關。Yang等[13]研究提示miR-146a過表達可能在動脈粥樣硬化的預防和治療中發揮作用。此外，腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)是多種miRNA的潛在靶基因[14-15]，提示MAPK可能通過調控miRNA在動脈血栓形成中的功能，促進動脈血栓形成。然而，miR-146b是否或如何參與DMCI的病理機制目前尚不清楚。糖尿病被認為是腦梗死的獨立危險因素，可加重神經細胞凋亡，提高腦梗死致殘率和死亡率，近年來，對DMCI的病理機制進行了深入研究，但對DMCI信號轉導機制知之甚少。本研究主要探討miR-146b-3p在糖尿病合并腦梗死發展中的作用，并闡述其部分分子機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取我院2015年4月—2017年12月收治的210例糖尿病病人為研究對象，對血栓事件發生率進行隨訪研究。糖尿病診斷依據1999年《世界衛生組織糖尿病診斷標準》；腦梗死診斷依據美國心臟協會/美國卒中協會(ASA)于2013年制定的標準[16]，并經顱內計算機斷層掃描磁共振成像(MRI)或兩者同時證實。排除標準：肝、腎、甲狀腺功能障礙；有心臟病、自身免疫性疾病、癌癥、感染性疾病、腦出血史的病人；1個月內有外傷或手術病人。

1.2 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測 血清IL-6和COX-2總蛋白含量采用ELISA檢測，采集外周血標本，空腹靜脈采血10 mL，體外用0.129 mmol/L檸檬酸鈉抗凝，充分搖管，室溫保存檢查。所有樣本至少重復檢測3次。

1.3 外周血單核細胞(PBMC)分離 清晨抽取病人外周血4 mL，肝素抗凝，低速離心15 min。然后以RPMI 1640培養基體積稀釋中間層白膜約1 mL，混合后緩慢擴散于2 mL淋巴細胞的分離液表面。從分離液和RPMI 1640中間分離出單核細胞，洗滌3次保存。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測 使用total RNA試劑盒(Qiagen)從PBMC中提取得到總RNA，進行反轉錄，構建cDNA文庫，最終采用RT-PCR進行檢測miR-146b-3p、RAF1、COX-2的表達。通過SYBR Green Master Mix Kit和ABI 7500 real-time PCR系統(Applied Biosystems， Waltham， MA)測定，并歸一化為GDPAH。相關基因引物見表1。具體的PCR條件參考文獻[17]。每個基因的聚合酶鏈式反應研究重復3次。

表1 基因引物序列

1.5 免疫印跡法(Western Blot)檢測 根據細胞量加入適量RIPA細胞裂解液，提取各組細胞的蛋白。配制10%SDS-PAGE，每孔加入30 μg蛋白樣品，經SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h， TBST稀釋一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；加入羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h；ECL發光：實驗重復3次。主要抗體為單克隆小鼠抗人COX-2 (1∶1 000， abcam， mouse)、兔抗人RAF1 (1∶5 000，abcam， rabbit)、 單克隆兔抗人p-p38MAPK (1∶1 000， cell signaling， rabbit)、兔抗人p38MAPK (1∶5 000，cell signaling， rabbit)、單克隆小鼠抗人P-STAT3 (1∶5 000， abcam， mouse)、兔抗人STAT3抗體 (1∶1 000， abcam， rabbit)和兔抗人GAPDH抗體 (1∶1 000， cell signaling， rabbit)。上述抗體均購自美國CST公司。

2 結 果

2.1 隨訪期間血栓事件發生情況 本研究中，210例病人隨訪時間為(8.1～21.3)個月。共發生血栓事件33例(包括腦梗死15例，心肌梗死18例)，血栓事件發生率為15.71%。將發生腦梗死的15例歸入DMCI組，男10例，女5例；年齡56～84(72.15±1.17)歲。另選取15例無腦梗死病人為對照組，男10例，女5例；年齡58～77(74.85±3.31)歲。

2.2 兩組臨床資料比較(見表2)

表2 兩組臨床資料比較

2.3 DMCI組與對照組外周血IL-6、COX-2的表達比較 利用ELISA法檢測病人外周血IL-6和COX-2含量顯示，與對照組相比，DMCI組血IL-6和COX-2表達均明顯升高(P<0.05)。詳見圖1、圖2。

2.4 IL-6在外周血單核細胞中誘導COX-2表達比較 在外周血單核細胞中加入IL-6進行誘導，發現COX-2的mRNA和蛋白表達明顯增加，隨著IL-6的升高，COX-2明顯降低。其中COX-2 mRNA表達在IL-6刺激后1 h達到峰值；COX-2蛋白表達略晚于mRNA，在IL-6誘導后2 h達到峰值，然后逐漸下降(P<0.01)。詳見圖3。實驗結果表明，COX-2的表達受IL-6的調控。

與對照組比較， ＊P<0.05。圖1 ELISA檢測外周血IL-6水平(n=3)

與對照組比較， ＊P<0.05。圖2 ELISA法檢測外周血COX-2水平(n=3)

圖3 IL-6誘導外周血單核細胞COX-2表達(n=3)

2.5 DMCI組與對照組miR-146b-3p表達比較 采用RT-PCR技術檢測15例DMCI病人miR-146b-3p的表達情況。結果顯示，與對照組相比，miRNA-146b-3p mRNA在15例DMCI病人中的表達均下調(見圖4A)；DMCI組miR-146b-3p mRNA的表達低于對照組(0.16±0.07與1.12±0.16，P<0.001)。詳見圖4B。

與對照組比較，＊P<0.001。圖4 采用RT-PCR技術檢測DMCI病人miR-146b-3p表達情況

2.6 DMCI組病人RAF1及P38MAPK的表達情況 采用PCR技術檢測DMCI病人RAF1表達情況，通過免疫印跡方法檢測RAF1、p38MAPK、COX-2蛋白的表達。結果顯示，與對照組比較，DMCI組RAF1 mRNA表達均增加(見圖5A)，DMCI組RAF1 mRNA表達高于對照組(P<0.001，見圖5B)，且蛋白表達也是增加的(見圖5C)；檢測COX-2、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表達，發現在DMCI病人中COX-2、p-p38MAPK表達是增加的，p38MAPK蛋白的表達是減少的(見圖5C)，說明DMCI病人中p38MAPK磷酸化激活了p38MAPK的信號通路。

與對照組比較，＊P<0.001。圖5 兩組病人中RAF1及p38MAPK蛋白表達情況

2.7 IL-6激活STAT3、下調miR-146b-3p誘導COX-2在外周血單核細胞中的表達 DMCI組與對照組外周血IL-6、COX-2的表達結果顯示COX-2的表達受IL-6的調控，因此，進一步探討IL-6與miR-146b-3p及COX-2之間的聯系。結果顯示，當用10 ng/mL的IL-6處理外周血單核細胞(PBMC)時，處理5 min時可激活STAT3磷酸化，處理15 min后p-STAT3表達達峰值，然后逐漸下降(P<0.01，見圖6A)。當IL-6處理PBMC 1 h后，miR-146b-3p mRNA表達明顯下降，且下降趨勢明顯(見圖6B)。當IL-6處理12 h后，發現miR-146b-3p mRNA在IL-6 處理12 h時表達為(0.20±0.12)，低于對照組的(1.02±0.15)，差異有統計學意義(P<0.05，見圖6C)。經IL-6處理后COX-2的mRNA為(4.98±0.69)和蛋白質表達高于對照組(1.46±0.23，P<0.05，見圖6D、圖6E)。

與對照組比較，＊P<0.05。圖6 IL-6激活STAT3、下調miR-146b-3p誘導外周血單核細胞中COX-2表達

2.8 DMCI組其他miRNAs的表達情況 通過RT-PCR檢測DMCI組病人中其他35個miRNAs的表達情況。結果發現，與對照組相比，DMCI組有23個miRNAs表達降低(包括miR-146b-3p)，12個miRNAs表達上調(見圖7)；DMCI組miR-146a表達也是降低的，與miR-146b的表達趨勢一致，說明miR-146a與miR-146b在大腦發育和進展中發揮類似作用，相關作用機制有可能也是相似的。

圖7 RT-PCR檢測DMCI組中35個miRNAs的相對表達

3 討 論

炎癥是腦梗死后嚴重的生理反應之一[18-19]。有研究認為糖尿病可加重缺血性腦彌散后的急性炎癥反應，增加腦組織的炎性因子表達，其中炎性因子COX分為COX-1和COX-2兩大類[20-22]。在人的腦組織中， COX-2通常位于皮質、海馬、下丘腦和脊索中樞，在其他炎癥因素的刺激下，COX-2的表達明顯增加，如炎癥細胞因子IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管緊張素Ⅱ (Ang Ⅱ)等[23-26]。既往研究報道，COX-2不僅介導全身炎癥反應，而且在動脈粥樣硬化病變中起重要作用，受多種炎癥細胞因子調控[27-29]。本研究中，與正常組比較，DMCI組病人血清中IL-6、COX-2表達明顯升高。目前，一些miRNA已被證實在動脈粥樣硬化病理生理學中發揮關鍵作用[30-32]。本研究結果顯示，與正常組比較，DMCI組miR-146b-3p明顯下調，證實miR-146b-3p調控RAF1表達，最終使p38MAPK信號激活。DMCI組病人miR-146b-3p表達下調，從而誘導了RAF1的表達增加，然后激活誘導COX-2上調的p38MAPK信號通路，最終促進動脈血栓的形成。此外，IL-6被證實可以刺激單核細胞中STAT3的表達，而單核細胞中STAT3的表達與STAT信號通路密切相關[33-35]。識別STAT3的結合位點存在于miR-146b-3p中，miR-146b-3p的表達與STAT3的重構密切相關[36]。

本研究還證實STAT3信號通路在動脈血栓形成過程中被激活，這與IL-6的上調密切相關。STAT3誘導miRNA-146b-3p下調。DMCI的發展也證實了COX-2通過MAPK信號轉導通路調控表達。有效靶向miR-146b-3p/RAF1/P38MAPK/COX-2信號通路的干預，將為DMCI的防治提供潛在靶點。本研究只比較了DMCI病人與無腦梗死的糖尿病病人間差異，其他并發癥的糖尿病病人或僅缺血性卒中病人不包括在內。miR-146b-3p通過抑制ADA2參與調節糖尿病退行性炎癥，提示miR-146b與糖尿病微血管并發癥的關系[37]；其他研究證實miR-146a表達在糖尿病缺血性腦卒中病人中表達下調，但僅在缺血性腦卒中病人中表達下調，血液中miR-146a低表達是我國糖尿病病人缺血性卒中的危險因素[38-40]。本研究也發現DMCI病人中miR-146a表達是下調的，結果提示了miR-146b與DMCI之間的關系，也可以認為miR-146a在大腦的發育和進展中發揮了作用。

綜上所述，本研究發現miR-146b-3p的表達通過介導RAF1/P38MAPK/COX-2信號通路與DMCI的發展密切相關。miR-146b-3p表達異常似乎是DMCI發展的關鍵因素，可能成為DMCI檢測和干預的新靶點。