急性缺血性腦卒中病人血漿miR-141、PAPP-A水平與疾病嚴(yán)重程度和短期轉(zhuǎn)歸的關(guān)系

劉曉琳，朱艷玲，郭麗莎，郝文莉

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是最常見的腦卒中類型，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，占我國(guó)腦卒中的69.6%～70.8%[1]。臨床對(duì)急性腦卒中病人轉(zhuǎn)歸結(jié)局的判斷主要依據(jù)影像學(xué)結(jié)果和臨床經(jīng)驗(yàn)，而對(duì)血糖等血液生化指標(biāo)外的生物標(biāo)志物研究較少。microRNAs(miRNAs)具有重要的生物學(xué)功能，參與生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs與AIS病人預(yù)后有關(guān)[2]。有研究表明，miR-141在膠質(zhì)瘤癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，與腫瘤大小、分化程度及是否轉(zhuǎn)移相關(guān)[3]。妊娠相關(guān)血漿蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)作為金屬蛋白鋅家族中的成員之一，可減少纖維蛋白的溶解，促進(jìn)凝血過程，進(jìn)一步使內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)重塑，加速斑塊的不穩(wěn)定[4]。研究表明，PAPP-A在AIS病人血漿中高表達(dá)，可作為腦卒中的預(yù)測(cè)因子及預(yù)后指標(biāo)[5]。但miR-141與PAPP-A在AIS病人血漿中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究對(duì)miR-141、PAPP-A在AIS病人血漿的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并探討二者與AIS病人腦卒中嚴(yán)重程度和短期轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年12月—2019年12月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院的AIS病人183例，其中，男99例，女84例；年齡50～79(62.30±9.20)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南(2018)中診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；②經(jīng)1.5T或3.0T磁共振成像(MRI)診斷證實(shí)；③病人臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能異常或惡性腫瘤者；②入院前1個(gè)月內(nèi)有嚴(yán)重感染或近期(發(fā)病前2周內(nèi))有手術(shù)和創(chuàng)傷史；③出血性腦血管病或短暫性腦缺血發(fā)作；④接受靜脈溶栓以及血管內(nèi)治療或免疫抑制劑治療等；⑤臨床資料不全者。依據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)[6-7]評(píng)分，將病人分為輕度卒中組(NIHSS評(píng)分≤8分，115例)及中重度卒中組(NIHSS評(píng)分>8分，68例)。腦卒中后14 d采用改良Rankin量表(Modified Rankin Scale，mRS)[8]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，mRS 評(píng)分0～2分為轉(zhuǎn)歸良好，mRS評(píng)分3～5分或死亡為轉(zhuǎn)歸不良。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自大連TAKARA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司，miR-141及U6引物，由上海生工生物公司設(shè)計(jì)與合成；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PAPP-A檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 血漿樣品：采集AIS病人空腹靜脈血5 mL，裝入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)抗凝管，常溫3 000×g離心10 min后收集血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)血漿中miR-141的表達(dá) 按照RNA提取試劑盒方法、步驟抽提血漿中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 TOYOBO)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miR-141基因和U6基因序列設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程公司合成，引物序列見表1，反應(yīng)總體系20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、90 s，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、15 s，38個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，以U6作為內(nèi)參，采用2-??CT分析法計(jì)算miR-141表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血漿PAPP-A水平 采用ELISA法檢測(cè)血漿PAPP-A水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 輕度卒中組與中重度卒中組臨床資料比較 輕度卒中組高血壓、冠心病、空腹血糖、C反應(yīng)蛋白、miR-141、PAPP-A水平與中重度卒中組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 輕度卒中組與中重度卒中組臨床資料比較

2.2 Logistic回歸分析AIS嚴(yán)重程度的影響因素 將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量作為自變量，腦卒中嚴(yán)重程度作為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，miR-141、PAPP-A、高血壓、冠心病、空腹血糖和C反應(yīng)蛋白是腦卒中嚴(yán)重程度的影響因素(P<0.05)。詳見表3。

表3 AIS嚴(yán)重程度影響因素的Logistic回歸分析

2.3 轉(zhuǎn)歸良好組與轉(zhuǎn)歸不良組臨床資料比較 轉(zhuǎn)歸良好組糖尿病、冠心病、收縮壓、空腹血糖、C反應(yīng)蛋白、miR-141、PAPP-A水平及基線NIHSS評(píng)分與轉(zhuǎn)歸不良組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 轉(zhuǎn)歸良好組與轉(zhuǎn)歸不良組臨床資料比較

2.4 Logistic回歸分析AIS病人短期轉(zhuǎn)歸的影響因素 將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量作為自變量，病人短期轉(zhuǎn)歸情況作為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，miR-141、PAPP-A、糖尿病、冠心病、空腹血糖、C反應(yīng)蛋白和基線NIHSS評(píng)分是短期轉(zhuǎn)歸不良的影響因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 短期轉(zhuǎn)歸不良危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

3 討 論

缺血性腦卒中為神經(jīng)內(nèi)科常見疾病，是中老年人最常見的腦血管疾病之一，臨床表現(xiàn)以神經(jīng)功能缺損為主，具有高發(fā)率、高死亡率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)[9-10]。因此，尋找影響疾病嚴(yán)重程度并識(shí)別預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，對(duì)腦卒中的預(yù)防和治療尤為重要。

miRNA與腦組織發(fā)育、分化、生理功能及病變等密切相關(guān)，可參與炎癥、促血管形成過程或抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖來發(fā)揮抗血管形成等多種與缺血性腦卒中相關(guān)的作用。Aconetti等[11]研究表明miR-23b在頸動(dòng)脈球囊血管損傷大鼠中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)miR-23b可減少內(nèi)膜增生，調(diào)節(jié)血管損傷后血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。侯麗淳等[12]研究表明缺血性腦卒中病人血漿中miRNA-145表達(dá)水平升高、miRNA-146a表達(dá)水平降低，與缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。劉大全等[13]研究表明miR-141能通過增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力，進(jìn)而促進(jìn)血管新生。Liu等[14]利用缺氧處理大鼠腸系膜上動(dòng)脈和血管平滑肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-141可參與缺氧和出血后血管反應(yīng)活性的調(diào)控。本研究顯示，與輕度卒中組比較，中重度卒中組血漿miR-141表達(dá)水平明顯降低，Logistic回歸分析顯示miR-141與AIS嚴(yán)重程度有關(guān)，miR-141水平降低是轉(zhuǎn)歸不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推測(cè)低水平miR-141可能對(duì)血管新生的促進(jìn)作用較弱，不利于病人轉(zhuǎn)歸。

PAPP-A是金屬蛋白鋅家族中的成員之一，在炎性反應(yīng)過程中可導(dǎo)致斑塊破裂，引發(fā)腦梗死，其水平升高可反映動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性[10，15]。Wang等[16]研究表明PAPP-A在缺血性腦卒中病人血漿高表達(dá)，與缺血性腦卒中的嚴(yán)重程度或預(yù)后相關(guān)。生曉娜等[17]研究表明在急性缺血性腦血管病病人中，頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成者血漿PAPP-A水平升高，與急性缺血性腦血管病病人頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。Zhang等[18]研究表明，miR141可通過作用于PAPP-A，抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，中重度卒中組血漿PAPP-A水平明顯高于輕度卒中組，Logistic回歸分析提示，血漿PAPP-A水平與AIS嚴(yán)重程度相關(guān)，推測(cè)PAPP-A水平高可能影響血管流通性，進(jìn)而影響AIS嚴(yán)重程度。轉(zhuǎn)歸不良組PAPP-A水平明顯高于轉(zhuǎn)歸良好組，PAPP-A水平增高是轉(zhuǎn)歸不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示PAPP-A可能作為AIS病人潛在預(yù)后標(biāo)志物。

綜上所述，AIS病人血漿中miR-141低表達(dá)、PAPP-A高表達(dá)，二者與腦卒中嚴(yán)重程度和短期轉(zhuǎn)歸有關(guān)，可能作為AIS病人潛在的預(yù)后標(biāo)志物。但由于本研究樣本量有限，仍需擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步研究。