高效液相色譜法同時測定食品中兩種非食用色素的含量

◎ 李 濤，周 瓊

（1安康市質量技術檢驗檢測中心，陜西 安康 725000；2陜西省富硒食品工程實驗室，陜西 安康 725000）

近年來，一些不法食品經營者為了獲取更大利益，打著食品添加劑的旗號，在食品中添加非食用物質，對人們的生命和健康造成巨大傷害，如三聚氰胺、吊白塊、蘇丹紅、堿性橙等，引發了重大的食品安全事故。

在這些非法添加物中，蘇丹紅、堿性橙這兩種非食用色素被使用的頻率較高。蘇丹紅和堿性橙種類多樣，單獨或重疊使用都能使產品呈現良好的色澤，且成本低廉，增加了產品競爭力。國家技術部門出臺了相應的檢測方法標準[1-2]，只能對蘇丹紅和堿性橙分別進行檢測，檢測效率較低。若能同時檢測這兩種非食用色素，則能很大程度地提高檢測效率、降低檢驗成本。本研究結合蘇丹紅和堿性橙的檢測條件，建立了同時檢測蘇丹紅和堿性橙的分析方法，快速準確，具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐干、豆油皮、腐竹、豆腐乳、豆瓣醬、辣椒醬和辣椒面等，購自陜西省安康市本地市場；標準品[堿性橙2（CAS號：532-82-1，純度≥99.9%）、堿性橙21（CAS號：3056-93-7，純度≥96.7%）、堿性橙22（CAS號：4657-00-5，純度≥99.9%）]，購自海安譜實驗科技股份有限公司；蘇丹紅Ⅰ（編號：GBW10056純度為≥99.9%），購自中國計量科學院研究院；所有試驗用水符合GB/T 6682—2008中一級水要求（超純水）；乙酸銨（分析純）；無水硫酸鈉（分析純）；氨水（分析純）；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；磷酸（分析純）。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀：LC-20A，島津公司；紫外檢測器；C18色譜柱（島津Inertsil公司250 mm×4.6 mm，5 μm）；超聲波清洗儀；超純水器；電子天平；離心機；針頭過濾器：孔徑為0.45 μm有機微孔濾膜。

1.3 樣品處理

將樣品攪碎，稱取2 g（精確至0.001 g）樣品于25 mL離心管中，加入1 mL蒸餾水潤濕樣品；用10%（V/V）氨水調節樣品至pH為7～8，加入5 mL乙腈提取，振蕩10 min，超聲10 min，4 000 r·min-1離心5 min；將上清液移入10 mL容量瓶中，向殘渣中再加入5 mL堿性甲醇，振蕩10 min，超聲10 min，4 000 r·min-1離心5 min；合并上清液，用甲醇定容至10 mL；過0.45 μm濾膜，供HPLC分析[3-5]。

1.4 標準曲線繪制

1.4.1 標準溶液制備

分別稱取標準品堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ各50 mg，（精確至0.000 1 g），置于100 mL棕色容量瓶中，加90%乙腈超聲使之完全溶解，定容，搖勻。所配溶液中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ濃度均為500 μg·mL-1標準儲備液，于4 ℃保存。

1.4.2 標準中間液

準確移取堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ標準貯備液各5 mL，分別置于50 mL棕色容量瓶中，用90%乙腈定容至刻度。所配溶液中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ濃度均為50 μg·mL-1，于4 ℃保存。

1.4.3 標準工作溶液

準確移取堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ染料標準中間液各0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、7.5 mL和10.0 mL于50 mL棕色容量瓶中，用90%乙腈定容至刻度。此時，混合溶液中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ染料的濃度分別為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、7.5 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1。將配制好的標準工作溶液，繪制以峰面積為縱坐標，工作溶液濃度為橫坐標的標準曲線。

1.5 色譜條件

色 譜 柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），島津Inertsil公司；流動相：甲醇-乙酸銨（pH 4.5，20 mmol·L-1）；流速以1.0 mL·min-1進行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；柱溫：40 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：450 nm；進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序表

1.6 樣品分析

按照1.5中的色譜條件檢測待測樣品，繪制標準曲線并比較，依據保留時間進行定性分析，采用外標峰面積法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 流動相的選擇

根據蘇丹紅和堿性橙的分析方法，采用梯度洗脫程序，分別試驗了甲醇-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙酸銨溶液等作為流動相，探究其對堿性橙和蘇丹紅分離效果的影響，結果發現，甲醇-乙酸銨作為流動相時，蘇丹紅和堿性橙的分離效果、峰型及線性關系都比較理想，采用其他流動相時，或有組分缺失，或有幾種組分重疊無法分離的問題。

關于流動相中乙酸銨的濃度，分別采用20 mmol·L-1和50 mmol·L-1乙酸銨進行試驗，二者都能達到良好效果，且50 mmol·L-1時響應值稍高，但柱壓相應增加，在分離效果方面二者無大的差別。若乙酸銨濃度高，溶質在系統中析出程度增加，對系統的穩定和后期沖洗造成影響。因此，為避免高濃度乙酸銨在系統中析出的影響，本試驗采用20 mmol·L-1乙酸銨作為流動相。同時參考有關資料，對乙酸銨在不同pH值下的分離效果進行比較試驗[3]，用1 mol·L-1磷酸調節pH值為3.5、4.5、5.5和6.5，結果發現當pH值為4.5時，效果最好。但結合實際，不同的色譜柱性能有差異，對酸度的適應有所不同，不一定每支色譜柱在pH值為4.5時效果最好。

關于梯度洗脫條件，上述條件只是其中一種。甲醇含量增加，分離速度快，但分離效果降低；甲醇含量降低，分離速度減慢，分離效果變好。如果降低初始甲醇含量至30%左右，減緩甲醇比例上升速度，則分離效果更好一些，但4種組分出峰時間會相應延長2～5 min。

2.1.2 檢測波長的選擇

有關資料顯示[2]，堿性橙2在波長450 nm處有最大吸收，堿性橙21、堿性橙22和蘇丹紅Ⅰ在480 nm處有最大吸收，本試驗對這兩個波長進行了比較，結果發現，在波長為450 nm時，4種組分都能達到滿意的檢測效果，而在480 nm時，堿性橙2的響應值不太理想，故而選擇波長為450 nm。

2.2 前處理條件選擇

提取堿性橙的溶劑有甲醇和乙醇，提取蘇丹紅的溶劑有乙腈和丙酮等，單獨使用某一種或某一類，都不能將幾種組分完全提取出來，回收率很低。經過試驗發現，乙腈提取蘇丹紅效果較好，堿性甲醇提取堿性橙效果較好，乙醇提取峰形雜亂不利于定性，故而采取乙腈-堿性甲醇的提取組合。調節pH值是為了使各個樣品保持統一穩定的酸堿環境，保證方法的重現性和穩定性，保證被檢組分的定性檢出。

2.3 標準曲線和檢出限

用1.5中的色譜條件分析4種非法添加色素（濃度均為10.0 mg·kg-1），標樣譜圖如圖1所示。4種組分得到很好分離。在標準系列中，4種組分的濃度分別為1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、7.5 mg·L-1和10.0 mg·L-1，在此范圍內，峰面積與濃度之間有良好的線性關系。同時測定4種組分的檢出限，均達到0.05 mg·L-1，具體如表2所示。

圖1 4種非法色素檢測譜圖

表2 4種組分線性范圍、回歸方程、線性相關系數和檢出限表

2.4 回收率和精密度試驗

分別選取2.0 g辣椒面和豆腐乳樣品（均未含堿性橙和蘇丹紅），添加4種組分的混合標準溶液，每個組分添加高低濃度各兩個平行樣，進行加標回收試驗?；厥章省⑾鄬ο嗖詈投肯奕绫?所示。結果表明，兩種樣品辣椒面和豆腐乳的兩平行試驗中堿性橙的回收率均大于80%，蘇丹紅Ⅰ的回收率≥89%。相對相差在3.8%～4.6%，4種組分的定量限在0.20 mg·kg-1。

表3 4種組的加標回收率、相對偏差表

2.5 樣品的含量測定

采用本方法對市售的豆腐干、豆油皮、腐竹、豆腐乳、豆瓣醬、辣椒醬和辣椒面共20份樣品中的非食用色素進行了檢測，具體情況見表4。

表4 不同食品中的色素檢測結果表

3 結語

采用本方法對安康本地產的辣椒面、辣椒醬、豆腐乳、豆瓣醬、腐竹、豆油皮等產品進行檢測，均未檢測出堿性橙和蘇丹紅。而且安康當地也沒有非法添加蘇丹紅和堿性橙的投訴，也沒有其他檢測機構在安康出產的食品中檢測出堿性橙和蘇丹紅的報告。本方法穩定可靠，快速準確，重現性好，檢測效率高，具有一定的參考價值。