miR-491-5p靶向CCL22對舌鱗狀細胞癌細胞增殖及凋亡的影響

湯丹萍 程志剛 鄧少林

(武漢市中心醫院口腔科，湖北 武漢 430000)

舌鱗狀細胞癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，其新發病例逐年增加，威脅著人類的健康和生命〔1,2〕。趨化因子配體(CCL)22是趨化因子組的成員之一，也稱為巨噬細胞來源的趨化因子(MDC)，由單核細胞和樹突細胞表達〔3〕。它主要由單核細胞來源的M2巨噬細胞合成，屬于CC族趨化因子，CCR4是CCL22的受體，在調節性T細胞(Tregs)和Th2細胞中表達，這在腫瘤治療中有一定的潛力〔4〕。據報道，CCL22在腫瘤微環境中的表達通過影響M1和M2樣巨噬細胞的平衡，導致舌鱗狀細胞癌患者預后惡化〔5,6〕。CCL22對舌鱗狀細胞癌細胞的細胞表型變化和腫瘤生長的影響尚未可知。miR-491-5p在多種癌癥中均出現表達失調〔7～10〕，但是miR-491-5p與CCL22在舌鱗狀細胞癌之間的關系尚未清楚。本研究旨在研究miR-491-5p對細胞增殖、凋亡的調控機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物SPF級BALB/C裸鼠(18～20 g)30只，購自湖南斯萊克實驗生物有限公司，遵守實驗動物管理和倫理委員會章程對動物進行飼養和相關實驗；人正常口腔角質細胞培養NHOK、人舌癌細胞TCA8113、UM1、SCC1均購自美國菌種保藏中心(ATCC)；杜氏培養基(DMEM)購自Gibco；胎牛血清購自Hyclone；噻唑藍(MTT)購自上海克拉瑪爾；LipofectamineTM2000購自北京宜科思源科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海通蔚公司；逆轉錄試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自Roche；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒均購自北京索萊寶公司；電化學發光(ECL)試劑盒購自北京普利萊基因技術公司；RIPA蛋白裂解液購自BestBio；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 細胞培養均用DMEM培養液(10%胎牛血清)進行培養，條件為：37℃、5% CO2的恒溫培養箱進行常規培養。

1.2.2細胞的分組 將正常培養的TCA8113細胞隨機分為miR-NC組、miR-491-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-491-5p組、si-NC組、si-CCL22組、miR-491-5p+pc DNA組、miR-491-5p+pc DNA-CCL22組。處理方法：將miR-NC、miR-491-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-491-5p、si-NC、si-CCL22、miR-491-5p mimics+pcDNA、miR-491-5p mimics+pc DNA-CCL22，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書要求轉染至TCA8113細胞，轉染6 h后，更換新鮮培養基繼續培養48 h，qRT-PCR檢測細胞的轉染效率。轉染成功后，用于后續試驗。

1.2.3RT-qPCR實驗 取適量需要檢測的細胞，用RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒提取細胞的總RNA并合成cDNA，將其用RT-qPCR試劑盒進行miR-491-5p、CCL22的檢測。結果以U6和GAPDH為內參，2-△△Ct法檢測計算miR-491-5p、CCL22的表達。引物序列：miR-491-5p：上游引物GGAGTGGGGAACCCTTCC，下游引物GTGCAGGGTCCGAGGT；內參U6：上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT；CCL22上游引物：GGCACCTATCCAGTGCCACA，下游引物TGGTGGACCAGCCTGAAACTC；內參GAPDH：上游引物TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，下游引物TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG。

1.2.4Western印跡 取適量需要檢測的細胞或充分研磨的組織勻漿，用蛋白裂解液充分裂解，再用BCA定量試劑盒進行定量，沸水浴變性后取上清進行SDS-PAGE。電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜，再將膜依次進行脫脂奶粉(2.5%，2 h)封閉、一抗孵育(4℃，過夜)和二抗孵育(37℃，1.5 h)。結束后用ECL發光液進行顯影曝光。結果以GAPDH為內參，目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的表達。

1.2.5MTT實驗 收集需要檢測的細胞，調至105個/ml，取100 μl接種至24孔板，每孔加入20 μl的MTT溶液，37℃孵育4 h，再加入150 μl的 DMSO，約2 min至完全溶解。設置酶標儀波長為490 nm，檢測細胞的吸光度(A)。

1.2.6流式細胞術 將需要檢測的細胞用結合緩沖液懸浮，待用。按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書要求操作，加入Annexin V-FITC和PI，反應20 min，盡快上流式細胞儀檢測分析結果。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測實驗 通過網站Target Scan(http://www.targetscan.org/)預測到miR-491-5p與CCL22之間存在互補的結合位點，為了驗證這一預測，將CCL22 3′UTR-WT(含野生型CCL22 3′UTR片段)和CCL22 3′UTR-MUT(含突變的CCL22 3′UTR片段)熒光素酶報告載體，分別與miR-491-5p、miR-NC共轉染，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作，記錄螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶激發值，以兩者的比值評價miR-491-5p與CCL22的結合力。

1.2.8裸鼠成瘤實驗 把SPF裸鼠分為control組、si-NC組和si-CCL22組，每組10只。用1 ml注射器吸取0.2 ml濃度為1×106個/ml的癌細胞，碘伏消毒后，裸鼠右前肢接種腫瘤，SPF環境下繼續飼養。接種后第3天開始，每周1次測量腫瘤的長a(cm)和寬b(cm)，約第45天，腫瘤生長已較大。斷頸法處死裸鼠，小心剝下瘤子，稱重。腫瘤體積的計算為V=a×b2×0.52(cm3)，取平均值。

1.3統計學方法 采用PEMS3.2軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1miR-491-5p、CCL22在舌鱗狀細胞癌細胞中的表達 與NHOK組相比，TCA8113組、UM1組、SCC1組舌鱗狀細胞癌細胞中miR-491-5p mRNA表達明顯降低，CCL22 的mRNA表達和蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。其中TCA8113細胞的變化最大，故選用該細胞用于后續研究。見圖1，表1。

圖1 CCL22在舌鱗狀細胞癌細胞中的蛋白表達

表1 miR-491-5p、CCL22在舌鱗狀細胞癌細胞中的表達

2.2過表達miR-491-5p對舌鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-491-5p組TCA8113細胞miR-491-5p mRNA表達顯著升高，在48、72 h時，細胞增殖顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)。見圖2，表2。

2.3miR-491-5p靶向CCL22 miR-491-5p的5′UTR端存在7個與CCL22的3′UTR端互補的核苷酸序列，見圖3。與miR-NC組相比，miR-491-5p組WT-CCL22細胞的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見表3。與anti-miR-NC組CCL22蛋白(0.99±0.04)相比，anti-miR-491-5p組(2.01±0.14)顯著升高，與miR-NC組CCL22蛋白(1.00±0.66)相比，miR-491-5p組(0.38±0.01)顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖2 過表達miR-491-5p的舌鱗狀細胞癌細胞凋亡

表2 過表達miR-491-5p對舌鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡的影響

圖3 miR-491-5p與CCL22的靶向結合位點

表3 雙熒光素酶報告基因檢測實驗結果

2.4敲減CCL22對舌鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡的影響 與si-NC組相比，si-CCL22組TCA8113細胞CCL22蛋白表達明顯降低，在48、72 h時，細胞增殖明顯降低，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖5，表4。

1～4：anti-miR-NC組，anti-miR-491-5p組，miR-NC組，miR-491-5p組

圖5 敲減CCL22的舌鱗狀細胞癌細胞中CCL22蛋白表達

表4 敲減CCL22對舌鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡的影響

2.5敲減CCL22抑制裸鼠成瘤 與si-NC組相比，si-CCL22組腫瘤組織CCL22蛋白表達明顯降低，腫瘤質量和體積也均明顯降低(P<0.05)。見圖6，表5。

圖6 裸鼠成瘤中CCL22的蛋白表達

2.6過表達CCL22逆轉miR-491-5p對舌鱗狀細胞癌細胞的增殖抑制和凋亡促進作用 與miR-491-5p+pc DNA組相比，miR-491-5p+pc DNA-CCL22組TCA8113細胞中miR-491-5p mRNA表達明顯降低，在48、72 h時，細胞增殖明顯升高，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見表6。

表5 敲減CCL22對腫瘤生長的影響

表6 過表達CCL22逆轉了過表達miR-491-5p對舌鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡的調控

3 討 論

miRNA在各種腫瘤中的功能已得到國內外的普遍認可，包括頭頸部腫瘤〔11,12〕。Huang等〔13〕在口腔鱗狀細胞癌的研究中報道，miR-491-5p表達異常降低，與患者總體存活率低顯著相關，G蛋白耦聯受體激酶相互作用蛋白(GIT)1為miR-491-5p的靶標，過表達miR-491-5p可抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的遷移和侵襲，揭示miR-491-5p是口腔鱗狀細胞癌預后的生物標志物。Zheng 等〔14〕發現，miR-491-3p在耐藥舌癌中的表達水平顯著降低，過表達miR-491-3p可增強舌癌細胞對化學治療的敏感性，miR-491-3p可靶向抑制mTORC2成分Rictor，低水平的miR-491-3p與舌癌患者的預后不良相關，揭示miR-491-3p/mTORC2信號通路的靶向干預提供了理論基礎，增強化療對舌癌的敏感性。本研究說明miR-491-3p對舌鱗狀細胞癌細胞的細胞表型有調控作用，為舌鱗狀細胞癌的診斷、治療提供新的生物標志物；miR-491-3p在舌鱗狀細胞癌中的功能機制與CCL22關系密切，為探索miR-491-3p在舌鱗狀細胞癌中的調控機制提供參考。趨化因子是一種小的促炎趨化因子，在許多腫瘤相關的生長、轉移和血管生成過程中發揮重要作用〔15,16〕。CCL22除了在先天免疫細胞活化和Th2中有腫脹效應外，在腫瘤發生發展中也有重要作用〔17〕。Kimura等〔6〕在舌鱗狀細胞癌的研究中報道，CCL22的表達量與癌癥的分級、患者總體存活率、CD8陽性細胞數量和腫瘤惡性指數顯著相關，表明，CCL22在腫瘤微環境中的表達通過影響M1和M2樣巨噬細胞的平衡導致舌鱗狀細胞癌患者的預后惡化。本研究結果說明CCL22的下調可抑制舌鱗狀細胞癌的惡化，提示CCL22抑制劑在抗舌鱗狀細胞癌中的巨大潛力。

綜上，miR-491-3p可抑制舌鱗狀細胞癌細胞的增殖和舌鱗狀細胞腫瘤的生長，促進凋亡，這與miR-491-3p靶向CCL22相關，為舌鱗狀細胞癌的靶向治療提供實驗依據。