基于UHPLC-MS/MS法測定雪蓮中的蘆丁和綠原酸含量*

白瑪央宗 白瑪拉珍 玉珠拉姆 馬超**

（1.西藏自治區高原生物研究所；2.西藏職業技術學院，西藏 拉薩 850000）

雪蓮是菊科風毛菊屬的植物(Saussurea DC),是西藏地區常見的土特產類藥材，雪蓮有雪蓮花(SI)、苞葉雪蓮(SO)、綿頭雪兔子(SL)、水母雪兔子(SM)、星狀雪兔子(SS)和三指雪兔子(ST)等80個品種,大部分品種主要分布在青藏高原及其毗鄰地區，包括尼泊爾和印度等地，俄羅斯也有分布[1-3]。雪蓮作為一種名貴的藥材主要是指雪蓮花(SI),《月王藥診》和《木草綱目拾遺》均有對天山雪蓮(SI)的記載。雪蓮集中生長在海拔較高的流石灘地區，裸露的特殊的生境，容易被發現，盡管海拔高但是容易采挖，一度瀕危[4]。

研究顯示雪蓮有良好的消炎止痛、抗腫瘤、抗氧化、降血脂等作用[5]，并含有如黃酮類、木脂素類、酚醛類、苯丙素類和倍半萜類化合物等生物活性物質[6-8]。現行中國藥典采用HPLC 法測定天山雪蓮中蘆丁和綠原酸含量作為標準[9]；達娃卓瑪等采用HPLC-DAD–ESI-MSn分析了不同產地三指雪兔子中8 種物質的含量[10]，以期達到規范檢查方法并應用到其他品種的目的；王強等采用高效液相色譜法測定10 批不同產地天山雪蓮中綠原酸和蘆丁的含量[11]；史俊友等采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 比色法對大苞雪蓮、綿頭雪蓮及水母雪蓮中總黃酮含量進行測定[12]。本實驗通過UHPLC-MS/MS 法對不同來源雪蓮中的藥典標志性成分含量進行檢測和評價，篩選優質雪蓮藏藥材，以期為雪蓮質量控制和針對性保護開發提供依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

20 份雪蓮樣品，其中1～15 號購自拉薩、林芝等地的農牧民及特產店，16～19 號樣品為課題組于2020 年7月采集，標本現存于西藏自治區高原生物研究所，20號為天山雪蓮。

1.2 試劑

標準物質綠原酸和蘆丁質量分數均≥98%，甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨都為色譜純，均購自百靈威科技有限公司。

1.3 儀器試劑

Waters Xevo TQ-S+ACQUITY UPLC 液質聯用儀（美國Waters 公司）；TG 16 臺式高速離心機(四川蜀科儀器有限公司)；MILLI-Q INTEGRAL 15 純水/超純水系統(美國Millipore 公司)；CPA225D 電子天平(德國Sartorius 公司)；LD-500 搖擺式中藥粉碎機（長沙市常宏制藥機械設備廠）；HYC-356醫用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司）；Eppendorf移液器（德國艾本德有限公司）；KQ5200DB 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A 旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備。樣品采用中藥粉碎機粉碎，用天平稱取樣品粉末0.10g，溶于10mL80%甲醇中，渦旋混勻后超聲提取40min，補足減失質量，室溫下8000rpm 離心5min，取上清液經0.22μm 微孔濾膜濾過，用80%甲醇分別稀釋10 倍、100 倍、1000 倍，然后轉移至96孔進樣板進樣。

2.1.2 標準品溶液的制備。精密稱取蘆丁、綠原酸標準品適量，分別置于10mL棕色容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，配成便準品溶液。次稀釋該標準溶液得到一系列校準溶液。

以上溶液均置于4℃冰箱冷藏備用。

2.2 色譜質譜條件

2.2.1 色譜條件。色譜柱：ACE Excel-2 C18-PFP 色譜柱(100mm×2.1mm,2.6μm)；流動相A：0.1%甲酸水（含5mM甲酸銨），流動相B：甲醇（含5mM甲酸銨），梯度洗脫5.5min。柱溫：35℃，進樣量3μL，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 質譜條件。離子源電噴霧離子源（ESI），正離子模式；噴霧毛細管電壓：3.0KV；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流速：800L/Hr；離子源溫度：150℃；掃描模式：MRM；綠原酸和蘆丁的離子對信息見表2。

表2 標準物質的質譜參數

2.3 線性關系、檢測限和定量限試驗

取“2.1.2”項下對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X），用內標法進行線性回歸，計算相關系數并得到回歸方程；通過其信噪比來計算檢出限和定量限，檢測限和定量限分別在信噪比為3 和10 時測定。結果顯示蘆丁和綠原酸線性關系良好，靈敏可靠，見表3。

表3 線性關系、檢測限和定量限

2.4 精密度試驗

取“2.1.2”項下的對照品溶液適量，在“2.2”項條件下連續進樣6次，測定各待測成分的峰面積，以峰面積的相對標準偏差（RSD），結果（表4）顯示均小于3%，表明該方法精密度良好。

表4 精確度、重復性、穩定性

2.5 重復性試驗

根據“2.1.1”項下的方法，取同一樣品制備6 份供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣，測定各成分峰面積的相對標準偏差（RSD），結果（結果）顯示均小于5.2%，表明該方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.1.1”項下供試品溶液適量，室溫下放置，第1 天、第2 天、第3 天分別按“2.2”項下試驗條件進樣，記錄各成分峰面積并計算其相對標準偏差（RSD），結果顯示，都小于3.4%，表明上述溶液穩定性良好。

2.7 加標回收率

取混合對照品溶液，按“2.2”項下方法測定連續進樣6 次，計算平均回收率，結果（表5）顯示各成分平均回收率為90%～108%，RSD 小于3.4%，表明本方法準確度良好。

表5 加標回收率

2.8 含量測定

取不同的雪蓮樣品適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件下進樣分析，平行測定3 次，測定各樣品中綠原酸和蘆丁的含量，結果（表6）發現20份雪蓮樣品都含有較高含量的綠原酸，其中采自察隅縣的18 號雪蓮樣品的綠原酸含量最高（10692.1μg/g），而蘆丁含量相差較大，天山雪蓮的蘆丁含量最高（6468.821μg/g），1、4、10、17雪蓮樣品幾乎不含蘆丁。

表6 樣品含量測定結果

3 討論

本研究建立了不同來源西藏雪蓮中蘆丁和綠原酸含量的UHPLC-MS/MS 測定方法，并與同樣測定方法下的天山雪蓮進行對照比較，發現天山雪蓮的蘆丁含量占優勢，而西藏雪蓮的綠原酸含量普遍較高且有4 個樣品的綠原酸含量高于天山雪蓮。中國藥典（2020 年版）要求天山雪蓮中無水蘆丁和綠原酸的含量均不得少于0.15%，采自察隅縣的18 號雪蓮樣品滿足這一條件的同時，綠原酸含量明顯高于天山雪蓮樣品。為雪蓮的深入研究和開發利用提供參考的同時，為其質量控制提供了一種新的模式。