乳腺癌晚期患者循環腫瘤細胞表型Vimentin mRNA與AKT1 mRNA水平表達對臨床療效評估的價值研究

歐陽航，陳德波，駱時木，楊培東，吳一波，張志珊

（福建醫科大學附屬泉州第一醫院 a.檢驗科；b.乳腺外科，福建泉州 362000）

每年在世界范圍內大約有170 萬例乳腺癌新發病例，發病率處于較高水平[1]。而在我國，女性乳腺癌的發病率同樣處于高水平，發病例數及死亡例數占全球的11.2%和9.2%[2]。當前依靠影像學評價治療療效有滯后的缺點，如果能有高效的監測指標，將避免部分患者因為無效治療或過度治療而導致治療失敗。因此，我們需尋找一種高效的評價乳腺癌患者治療療效的生物指標。

有研究發現，在乳腺癌患者的早期便可在外周血中發現循環腫瘤細胞（circulating tumor cells CTC）[3]。這部分CTC 可能具有不同的生理特點及致病機制，因此尋找具有特異性分子標志的高侵襲性CTC 亞群對研究疾病的預后及治療將有重要作用。CTC 從原發灶腫瘤組織中脫落進入外周血循環系統過程中會經歷上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT），研究發現該過程將極大提高腫瘤侵襲能力[4]。參與EMT 過程的間質標志物波型蛋白Vimentin 屬于纖絲蛋白家族中一員，其在腫瘤細胞中表達將增加腫瘤的生長速度和侵襲力。另有研究發現，蛋白激酶B（AKT1）作為PI3K/Akt 信號途徑中的核心成分，與腫瘤細胞增殖狀態相關。其在乳腺癌癌旁正常組織中無表達，在癌組織中高表達，提示AKT1 高表達可能在乳腺癌細胞癌變的過程中起一定作用[6]，目前尚未有關于CTC 中AKT1 的表達與晚期乳腺癌患者治療療效存在關聯的報告，因此有待進一步研究。本實驗將采用陰性富集技術進行乳腺癌患者CTC 富集，并聯合qRT-PCR 技術檢測EMT 間質標志物Vimentin mRNA、細胞增殖標志物AKT1 的mRNA表達情況，以期建立無創的外周血生物標志物監控腫瘤患者轉移及預后的方法，為乳腺癌患者的預后判斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本實驗收集從2018年6月～2020年1月期間，福建醫科大學附屬泉州第一醫院乳腺外科收治的經病理學初次確診為晚期乳腺癌的女性患者43 例，平均年齡49.6±9.3 歲，其中Ⅳ期轉移性乳腺癌患者27 例，Ⅲ期局部晚期乳腺癌患者16 例。另外納入15 例健康志愿者，平均年齡38.8±8.9 歲。分別抽取患者進行治療前及2 個周期治療結束后的靜脈血7.5ml。疾病組納入標準：①經我院確診為晚期乳腺癌的初治患者。主要包括初診即伴有遠處轉移或治療后出現復發轉移的乳腺癌、及不可手術的局部晚期乳腺癌（locally advanced breast cancer，LABC），病理分期上講通常指除T3N1M0 以外的IIIa，IIIb，IIIc 及IV 期乳腺癌。②患者依從性良好，ECOG 評分為0，1 或2。③根據實體瘤療效評價標準（RECIST）指南標準至少有一個可測量病灶。TNM 分期標準采用美國癌癥聯合委員會AJCC(第八版)標準。本研究已獲得泉州市第一醫院倫理委員會的批準書及受試者的知情同意。

1.2 儀器與試劑 循環腫瘤細胞差相富集試劑盒（美國Cytelligen 公司）；RNeasy Micro Kit（德國Qiagen）；RT-PCR 逆轉錄試劑盒SYBR 熒光染料（日本TaKaRa）；PCR 擴增儀（德國Eppendorf公司）；實時熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）；血清CEA，CA125 及CA15-3 檢測使用I2000SR 雅培全自動化學發光免疫分析儀及相應配套檢測試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 治療方法：患者治療方案包括化療或者化療聯合分子靶向治療、內分泌治療或者內分泌治療聯合分子靶向治療，所有治療方案均為2011 版中國乳腺癌臨床實踐指南所推薦的治療方案，且包含化療方案中化療線數不超過第三線。

1.3.2 CTC 的富集：為防止上皮細胞污染，棄掉前2ml 血液后，收集患者外周血7.5ml 于枸櫞酸鈉抗凝管，混勻，4h 內處理。按照循環腫瘤細胞差相富集試劑盒說明書操作步驟，待富集到循環腫瘤細胞，棄上清至100μl 后做進一步處理。

1.3.3 qRT-PCR 反應：按照RNeasy Micro Kit 操作說明提取上述100μl 細胞液的RNA 后，RT-PCR 逆轉錄試劑盒進行cDNA 合成，SYBR 熒光染料試劑盒進行qRT-PCR。實時定量PCR 引物由Primer Premier6 設計得出，合成由日本TaKaRa 完成。內參基因GAPDH正向：5’-CAAATTCC ATGGCACCGTCA-3’，反向：5’- GACTCCACGACGTACTCAGC-3’；Vimentin 正向：5’- AGTCCACTGAGTACCGGAGAC -3’，反向：5’- CATTTCACGCATCTGGCGTTC -3’；AKT1 正向：5’-CTGCACAAACGAGGGGAGTA-3’，反向：5’-TCACGTTGGTCCACATCCTG-3’。所得結果分析采用2-ΔΔCt方法。△△Ct=(待測樣品目的基因Ct平均值-待測樣本內參基因Ct平均值)-(健康對照樣品目的基因Ct平均值-健康對照樣本內參基因Ct平均值)。

1.3.4 乳腺癌患者療效評定標準：影像學RECIST評定標準：影像學的RECIST 標準是以患者治療2～3 個周期后，通過超聲或者CT 等影像方法測量實體腫瘤的最大經線，比較治療前后差異。治療的效果分為四類：疾病進展(progressive disease，PD)：基線病灶長徑總和增加≥20%或者出現新

的病灶；疾病穩定(stable disease，SD)：基線病灶長徑總和有縮小但未達到PR 或者有增加但未達到PD；部分緩解(partial response，PR)：基線病灶長徑總和縮小≥30%；完全緩解(complete response，CR)：所有目標病灶消失。以PR+CR 認定為治療有效，PD+SD 為治療無效。

1.4 統計學分析 實驗所得數據使用SPSS20.0 統計學軟件進行數據分析，采用GraphPad Prism 7.0軟件進行數據的作圖。計數資料采用率（%）表示，計量資料呈偏態分布時，用中位數(四分位數間距)表示，并用Wilcoxon 符號秩和檢驗比較。呈正態分布時采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用Student’st檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 治療前Vimentin mRNA 和AKT1 mRNA 的表達水平 乳腺癌組Vimentin mRNA 和AKT1 mRNA表達量（2.32±2.17，1.91±0.93）均大于健康對照組（1.22±0.76，1.23±0.83），差異具有統計學意義（t=2.841，2.480，均P＜0.05）。

2.2 治療前Vimentin 及AKT1 mRNA 表達量與臨床特征的相關性 見表1。AKT1 mRNA 表達量與晚期乳腺癌患者的臨床分期、ER 狀態、PR 狀態存在相關性（P＜0.05），Vimentin mRNA 表達量與患者的PR 狀態存在相關性（P＜0.05）。

表1 治療前Vimentin 和AKT1 mRNA 表達量與患者臨床特征的相關性（±s）

表1 治療前Vimentin 和AKT1 mRNA 表達量與患者臨床特征的相關性（±s）

臨床病理特征 nVimentin 表達量t 值P 值AKT1 表達量t 值P 值年齡（歲） ＜50242.18±2.31 0.4830.632 1.74±0.97 1.3380.188≥50192.50±2.022.13±0.88絕經狀態 絕經前282.09±2.18 0.9570.344 1.72±0.90 1.8940.065絕經后152.75±2.152.27±0.91 Ki67 ＜15%52.25±2.31 0.0770.939 1.58±0.79 0.8320.410≥15%382.32±2.181.96±0.96臨床分期情況 III 期162.59±2.45 0.6280.534 2.31±1.05 2.2700.029 IV 期272.16±2.021.67±0.79 ER 狀態 陽性231.84±2.18 1.5890.120 1.64±0.97 2.1280.039陰性202.87±2.072.23±0.80 PR 狀態 陽性231.54±1.65 2.6280.013 1.60±0.87 2.4560.018陰性203.21±2.382.27±0.91 HER-2 狀態 陽性192.86±2.66 1.4700.149 2.03±0.93 0.7170.478陰性241.89±1.621.82±0.95

2.3 治療前后Vimentin mRNA 和AKT1 mRNA 表達量變化與治療效果的相關性 在接受隨訪的38 例患者進一步復查且根據影像學RECIST1.1 標準對其評估治療療效。治療前乳腺癌患者的Vimentin mRNA相對表達量為2.32±2.17，治療后為1.30±0.75，治療前后差異具有統計學意義（t=2.879，P=0.006）；治療前AKT1 mRNA 相對表達量為1.91±0.93，治療后為1.52±0.57，治療前后的AKT1 mRNA 表達量差異具有統計學意義（t=2.282，P=0.026）。此外，治療后Vimentin mRNA 相對表達量降低的患者其治療有效率70.37%（19/27），高于治療后呈現升高者的27.27%（3/11）的治療有效率，差異具有統計學意義（Pa=0.028，a：Fisher’s exact test）。

3 討論

乳腺癌作為女性最常見的一種惡性腫瘤，僅2015年全球因乳腺癌死亡的人數約為50 萬，占因癌癥而死亡人數的14%[7]。CTC 作為“液態活檢”的良好指標，不僅對患者預后有提示意義，而且可以輔助乳腺癌早期診斷，CTC 變化的監測在臨床治療方案的選擇等方面同樣具有重要的指導意義[8]。有研究指出，CTC 上的分子表型可以用于證實腫瘤細胞在尚不明原因的轉移性患者中的性質和生物學起源[9]。如ARDAVANIS 等[10]的研究證實針對患者組織學檢測人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）狀態陰性但其外周血中的CTCs 表達HER-2 陽性的患者，也能從曲妥珠單抗治療中獲益。因此我們需要選取最有潛力的CTC 表型標志物作為監測指標。而在本研究選取的CTC 兩種表型標志物中，Vimentin作為EMT 過程中的重要間質型標志物，而AKT1基因則與腫瘤增殖狀態相關，最終會增強腫瘤細胞轉移的能力，在近年來一直受到關注。Vimentin 是保持細胞完整度的眾多中間絲中的一種蛋白質，可參與細胞黏附、遷移和運動。YU等[11]研究發現，乳腺癌患者中的CTC 可通過上皮-間質細胞轉化進入外周血循環中，因此部分CTC具有間質細胞表型的特征。另外王合兵等[12]人結論表明CK19 和Vimentin 在早期乳腺癌（I 期+II期）中表達相比健康組升高，這與本研究結果中發現的晚期乳腺癌組患者外周血CTC 中Vimentin mRNA 表達量高于健康對照組相似。有學者指出，Vimentin 過表達易導致癌細胞的轉移并影響患者的預后[13]。本研究通過檢測晚期乳腺癌患者治療前后Vimentin mRNA 表達量的變化佐證了該觀點。我們發現患者在治療后Vimentin 表達量較治療前有一定的降低，且在治療后Vimentin 表達量降低的患者有更高的治療有效率（P＜0.05），提示我們可通過觀察患者治療前后Vimentin 表達量的變化來監測治療療效。本研究中另一個CTC 相關表型標志物AKT 是PI3K/Akt 信號途徑中的核心成分，與調節細胞存活等多種重要的生物學功能具有相關性，與腫瘤細胞增殖能力有關。目前已有多種針對AKT的小分子抑制劑藥物研發，然而也有研究發現抑制AKT1 的功能后，反而促進了乳腺癌的轉移[14]。值得注意的是，我們發現相比Ⅲ期的局部晚期乳腺癌患者，IV 期的轉移性乳腺癌患者AKT1 mRNA 表達量更低。部分學者認為AKT1 在乳腺癌的增殖和轉移過程中發揮著不同的作用[15-16]。通過激活AKT1 可促進腫瘤細胞的增殖，但會抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移。相反當AKT1 功能受抑制而表達下降后，雖然癌細胞的生長受到抑制，但是其轉移能力則顯著加強。這或許解釋了本研究入組的IV 期轉移性乳腺癌患者其AKT1 mRNA 表達量更低的原因。此外通過檢測患者治療前后AKT1 mRNA 表達量，發現治療后表達量較治療前有一定的降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），但并未發現其表達量的降低與治療療效之間存在關系。AKT1 能否作為一個有效地監測療效的標志物還有待進一步的研究。

本研究通過實驗發現了CTC 表型標志物Vimentin，AKT1 對于晚期乳腺癌的療效監測有一定的應用價值，但尚存在一些不足。受限于研究時間，本研究中入組的樣本量較少，今后還將擴大樣本量做進一步研究。另外治療后CTC 表型標注Vimentin，AKT1 表達量的降低是否能改善患者的預后，在未做長期的隨訪前還暫時未知，今后我們也將繼續對這些患者進行跟蹤研究。