10株宮頸癌細胞系中MALAT1的表達及其對順鉑敏感性的影響

張治洋，李功娟

（1.安康市人民醫院婦科，陜西安康 725000；2.安康市漢濱區第一醫院婦科，陜西安康 725000）

宮頸癌(cervical cancer,CC)是常見的女性生殖道惡性腫瘤，其發病率和病死率均位居前列，對女性的生命健康構成了巨大威脅[1-2]。臨床上主要采用以手術為主、以放化療為輔的治療策略，但是對局部晚期患者而言治療效果并不理想[3]。目前國際上公認并推薦的宮頸癌防控方案是在適宜年齡段婦女群體中廣泛開展宮頸癌早篩，目的是早發現、早診斷和早治療。近幾年來隨著對宮頸癌研究的日益深入發現，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在調控宮頸癌發生、發展中起到了重要作用。肺腺癌轉錄相關轉錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1) 是lncRNA 家族中的重要成員[4]，已有報道MALAT1可促進宮頸癌的發生、侵襲和轉移，但其具體的調節機制、耐藥性以及在宮頸癌中的生物特性尚不清楚，仍需更深層次的研究。本研究選取10 株宮頸癌細胞系(BT-B，C-33A，CaSKi，MEG-01，Hela，HELA-S3，Ishikawa，RL95-2，HCC94 和MS751)，檢測宮頸癌細胞系中MALAT1 的表達及其對化療藥物順鉑敏感性的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究所用宮頸癌細胞系(BTB，C-33A，CaSKi，MEG-01，Hela，HELA-S3，Ishikawa，RL95-2，HCC94 和MS751)均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 試劑和儀器 RPMI-1640 培養液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS) 購自美國Gibco 公司，MALAT1 干擾質粒購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司，轉染試劑Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司，引物訂購于上海生工生物工程(股份)有限公司，使用ABI 7500 型PCR 儀進行實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR，qPCR)實驗，CCK-8 試劑盒購自Sigma-Aldrich 公司，siRNA 是由蘇州吉瑪基因公司合成。

1.3 方法 細胞培養條件：上述宮頸癌細胞系37℃下用含10g/dl FBS-RPMI-1640 培養液培養，待細胞匯合度達70%時更換培養液并進行傳代培養。

qPCR：采用TRIzol 法提取宮頸癌腫瘤組織中的總RNA，然后使用Takata 反轉錄試劑盒將RNA反轉錄制備成cDNA 文庫；PCR 經高溫變性、低溫退火、中溫延伸進行擴增，反應體系參照說明書配置，共進行20 個循環，使用β-Actin 作為內參。

細胞轉染實驗：根據產品說明書使用Lipofect amine 2000(Invitrogen)轉染試劑盒進行細胞轉染，siRNA 下調MALAT1 表達( 序列：5’-GACCTT GAAATCCATGACG-3’)。宮頸癌細胞系培養至70%～80%密度時進行轉染操作，采用RPMI-1640 培養液對MALAT1 進行稀釋，溫室孵育5min，以si-MALAT1 的細胞為干擾組，轉染無關序列的為陰性對照組。轉染后48 h 使用qPCR 測定轉染效率并進行后續實驗。

CCK-8 實驗：本研究擬采用CCK-8 實驗測定宮頸癌細胞系的增殖能力，實驗具體操作嚴格按照CCK-8 試劑盒說明書進行。按照每孔約200 個細胞接種在96 孔板中，每組設置5 個平行孔。將處于對數生長期的細胞轉染后分別培養0，24，48，72h和96 h，在每孔中加入10 μl 的CCK-8 試劑，在450 nm 波長下檢測其吸光度值，吸光度值愈高則表示孔內細胞越多。

化療敏感性實驗：取細胞轉染后處于對數生長期的細胞，消化重懸后按每孔約2×105個細胞接種于96 孔板中，同時每組設置5 個副孔。化療藥物(順鉑)按對數濃度設置加藥，常規培養24 h 后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer,PBS)清洗96 孔板，加入含20% CCK-8 試劑的培養液，2 h 后在450 nm波長下檢測其吸光度值。

1.4 統計學分析 采用GraphPad Prism 8 軟件進行實驗數據分析，計量資料采用t檢驗，以均數±標準差（±s）表示。qPCR結果采用2-ΔΔCt法進行分析，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MALAT1 在10 株宮頸癌細胞系中的相對表達量 MALAT1 在Ishikawa 細胞系中相對表達量為0.070±0.008；在BT-B 細胞系中相對表達量為0.059±0.003；在MS751 細胞系中相對表達量為0.057±0.005；在RL95-2 細胞系中相對表達量為0.051±0.007；在Hela 細胞系中相對表達量為0.027±0.003；在C-33A 細胞系中相對表達量為0.014±0.002；在CaSKi 細胞系中相對表達量為0.013±0.002；在HELA-S3 細胞系中相對表達量為0.012±0.003；在MEG-01 細胞系中相對表達量為0.003±0.001 和在HCC94 細胞系中相對表達量為0.002±0.001。MALAT1 在Ishikawa 細胞系中相對表達量顯著高于其他細胞株，差異均有統計學意義(t=18.207，19.488，25.277，71.174，96.039，97.754，96.002，117.526 和119.280，均P< 0.001)。MALAT1 在HCC94 細胞系中相對表達量顯著低于其他細胞株，差異均有統計學意義(t=119.280，254.912，152.543，98.000，111.803，75.895，69.570，44.721 和10.000，均P<0.001)。

2.2 CCK-8 實驗檢測450 nm 波長下吸光度值 見表1。CCK-8 實驗結果顯示：對于BT-B，C-33A，CaSKi，HELA-S3，HCC94 及MS751 細胞，24h 后即可觀察到CTR 組與siRNA 組的細胞增殖出現差異，siRNA組細胞增殖明顯較CTR組細胞顯著減弱，差異均有統計學意義(均P<0.05)。對于Hela，Ishikawa，RL95-2 及MEG-01 細胞，48h 后即可觀察到兩組細胞增殖出現差異，siRNA 組細胞增殖明顯較CTR 組細胞減弱，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

表1 CCK-8 實驗檢測450 nm 波長下吸光度值

2.3 干擾MALAT1 降低宮頸癌細胞對化療藥物的敏感性 通過改進CCK-8 實驗驗證了干擾MALAT1 后宮頸癌細胞對常見化療藥物順鉑敏感性的影響。實驗中，首先通過CCK-8 實驗測得各組細胞對順鉑的IC50，其中，BT-B 對順鉑的IC50 為14.72±3.89μmol/L，C-33A 對 順 鉑的IC50 為23.25±2.53μmol/L，CaSKi 對 順 鉑的IC50 為18.25±3.62μmol/L，MS751 對順鉑的IC50 為45.33±5.59μmol/L，Hela 對順鉑的IC50為11.23±2.66μmol/L，HELA-S3 對順鉑的IC50為15.25±3.21μmol/L，Ishikawa 對順鉑的IC50為19.22±5.26 μmol/L，RL95-2 對順鉑的IC50為44.21±3.23μmol/L，HCC94 對順鉑的IC50 為55.69±8.89μmol/L，MEG-01 對順鉑的IC50 為47.55±6.29μmol/L。

2.4 兩組化療藥物處理后細胞吸光度值比較 見表2。化療藥物處理后siRNA 組BT-B，C-33A，CaSKi，MS751，Hela，HELA-S3，Ishikawa，RL95-2，HCC94，MEG-01 等細胞在450nm 波長下的吸光度值顯著低于CTR 組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

表2 兩組化療藥物處理后細胞吸光度值比較

3 討論

宮頸癌嚴重威脅女性健康，且帶來了嚴重的疾病負擔[5-6]。近年來研究發現，lncRNA 在惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[7-9]。肺腺癌轉移相關轉錄本1(MALAT1)最早被報道是在非小細胞肺癌中發揮癌基因作用，后續研究發現其在腫瘤中通過多種途徑對腫瘤進行調控，能夠在轉錄及轉錄后水平對下游靶基因進行調控，對腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、轉移、EMT 等多種生物學過程產生影響，MALAT1 能夠促進肺腺癌細胞遷移和侵襲，且在膀胱癌中發揮抑制凋亡，促進細胞浸潤和轉移的作用[10-11]。另有報道顯示，MALAT1 可調節DNA甲基化以達到非小細胞肺癌侵襲的作用。MALAT1在惡性腫瘤發生、發展中作用的研究較多，但是關于其在腫瘤耐藥方面的研究尚不多，有文獻報道MALAT1 在直腸癌組織中高表達，且其高表達能夠降低直腸癌細胞對氟尿嘧啶、奧沙利順鉑的敏感性[12-13]。目前能夠見到在多種腫瘤中所起作用，但是尚未見到系統研究其在宮頸癌化療耐藥中所起作用的研究。

本研究通過對課題組保存的10 株宮頸癌細胞系中干擾MALAT1 后，檢測各株細胞增殖能力均降低，順鉑敏感性實驗發現干擾MALAT1 后，各株宮頸癌細胞系對順鉑的敏感性增加，以上結果說明MALAT1 能夠對宮頸癌患者順鉑耐藥產生影響。通過預測MALAT1 結合的miRNA，發現miR-126-5p 與其存在結合位點，通過系列實驗驗證發現，MALAT1 與miR-126-5p 存在靶向調控關系，MALAT1 能夠充當miR-126-5p 的分子海綿，對miR-126-5p 產生吸附效應[14]。通過在Ishikawa 細胞系中過表達及干擾miR-126-5p，發現過表達miR-126-5p 能夠抑制Ishikawa 細胞增殖，且能增加其對順鉑的敏感性。這與SUN 等[15]發表在Oncogene 雜志關于結直腸癌的研究類似，研究發現，在結直腸癌中，MALAT1 能夠充當miR-126-5p 的分子海綿，促進EMT，進而倒置結直腸癌侵襲和轉移[16]。

以上結果都顯示MALAT1 在宮頸癌中能夠通過靶向調控miR-126-5p 的表達，進而調節宮頸癌細胞對順鉑的敏感性，進而使宮頸癌患者對順鉑產生耐藥。