視黃酸通過GSK-3β 對大鼠缺氧缺血性腦損傷后海馬神經干細胞增殖的調節作用

李思雨 ,趙 敏 ,楊茂玲 ,肖 農 ,江 偉

（1.重慶醫科大學附屬兒童醫院康復科 兒童發育疾病研究教育部重點實驗室 國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心 兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地，重慶 400014；2.兒科學重慶市重點實驗室 認知發育與學習記憶障礙轉化醫學重慶市重點實驗室，重慶 400014）

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生兒常見的中樞神經系統疾病，嚴重時易導致神經系統后遺癥，甚至死亡。目前臨床治療手段主要有支持治療、亞低溫治療、高壓氧治療、藥物治療和間充質干細胞移植等［1］。但是上述治療方法有效性低，預后不良率較高，因此如何改善HIBD 損傷后神經功能的修復及尋找有效的神經保護療法一直是兒科醫學研究的重點和熱點［1-2］。研究［3］顯示：在模擬的HIBD 動物模型中，損傷后的神經干細胞和祖細胞能促進自我修復和功能恢復。作為體內重要營養元素之一的維生素A也是研究HIBD 損傷后修復機制的熱點。視黃酸（retinoic acid，RA）是維生素A 的活性代謝產物，主要通過其核受體發揮廣泛的生物學功能。研究［4-6］顯示：嚙齒動物的神經認知功能受到體內RA 水平的影響；神經細胞的增殖再生與Wnt 和RA 等信號通路有關。視黃酸核受體α（retinoic acid receptor alpha，RARα）是RA 受體在腦中表達的優勢受體［7］，并且RARα 在大鼠HIBD 后的學習和記憶功能恢復過程中發揮重要作用［8-9］。糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）是一種廣泛表達于中樞神經系統的絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與調控細胞內糖代謝、細胞增殖分化和凋亡等生理過程。海馬組織中GSK-3β 的激活在損傷成年海馬神經新生過程中起重要作用［10］。G1/S-特異性周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin-D1，CyclinD1）是參與調控細胞周期的核心蛋白，可以作為檢測細胞增殖程度的指標。CyclinD1 基因表達增加時能夠促進神經干細胞的增殖［11］。本課題組前期研究［12］顯示：適當濃度（1～5 μmol·L－1）RA 處理氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）損傷后的PC12 細胞可以增加RAR α、GSK-3β 和CyclinD1 mRNA 及蛋白表達水平，進而促進細胞增殖。因此本研究在大鼠海馬神經干細胞中探討不同濃度RA 對細胞增殖的影響以及RA 對RARα、GSK-3β 和CyclinD1 表達的影響，并且進一步探討RA 可能的作用機制，為預防和治療腦損傷提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF 級健康Sprague-Dawley（SD）孕鼠（孕16～18 d），購于重慶醫科大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2018-0003。DMEM 培養基、DMEM/F12 培養基和胎牛血清購自美國Gibco 公司，M199 培養基購自美國Hyclone 公司，Rat FGF-basic 和Rat EGF 購自美國PeproTech 公司，RA（全反式視黃酸）購自美國Sigma 公司，CHIR99021 購自美國Cayman 公司，RARα 和Nestin一抗購自美國Abcam 公司，CyclinD1、GSK-3β 和β-actin 購自美國Cell Signaling Technology 公 司，RNA 提取試劑盒購自美國Bioteck 公司，cDNA 合成試劑盒（RR047A）和SYBR-Green Real-time PCR（RR820A）試劑購自日本TaKaRa 公 司，BCA 蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒和SDSPAGE 凝膠配制試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司，CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒購自日本同仁公司。CO2細胞培養箱、三氣細胞培養箱和紫外分光光度儀購自美國Thermo 公司，熒光顯微攝像系統購自日本Nicon 公司，逆轉錄系統、實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）系統、凝膠電泳系統、電轉系統和成像系統購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 原代海馬神經干細胞的分離和培養麻醉孕鼠，75%乙醇消毒，在無菌條件下取出SD 大鼠胎鼠，分離顱骨及硬腦膜，去除間腦、小腦、腦膜和血管，取海馬組織置于含1%雙抗+10%胎牛血清的DMEM/F12 培養基中，剪碎腦組織，輕吹打數次，200 目細胞篩過濾，1 500 r·min－1離心5 min，加入適量培養基，混勻，接種于10 cm 培養皿中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養，第2 天DMEM/F12 培養基+20 mg·L－1EGF+20 mg·L－1bFGF+1%雙抗+2% B27 混合培養基全量換液，第3～4 天進行半量換液，第5 天進行RA 干預，第6 天進行抑制劑CHIR99021 干預及OGD 損傷。

1.3 原代海馬神經干細胞OGD 損傷將培養的神經干細胞接種于6 孔細胞培養板中，在缺氧前24 h分別以0、0.5、1.0、5.0、10.0 和50.0 μmol·L－1RA 進行干預并分組，對照組未進行OGD 損傷和試劑干預。給予無糖M199 培養基并在三氣細胞培養箱中給予95% N2+5% O2混合氣培養2 h，模擬缺血缺氧，進行OGD 建模。在缺氧前2 h 加入相應體積GSK-3β 抑制劑CHIR99021。

1.4 原代海馬神經干細胞的鑒定將生長良好的神經干細胞接種到多聚賴氨酸包被過的蓋玻片上，將蓋玻片置于24 孔細胞培養板中，加入培養液，37 ℃、5% CO2條件下培養12 h，細胞貼壁后吸出培養液，PBS 緩沖液沖洗，4% 多聚甲醛固定30 min 后PBS 緩沖液沖洗，0.3% Triton X-100 的PBS 緩沖液37 ℃孵育10 min 后PBS 緩沖液沖洗，10%山羊血清室溫封閉30 min，加入Nestin 抗體100 μL（1∶200），濕盒4 ℃過夜。PBS 緩沖液沖洗，加入二抗（1∶200），37 ℃避光孵育40 min。PBS 緩沖液沖洗，避光晾干。熒光封片劑封片。暗室熒光顯微鏡下觀察。

1.5 原代海馬神經干細胞OGD 損傷后CCK8 法檢測細胞增殖活性按照CCK8 細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作。預先使用多聚賴氨酸溶液包被96 孔細胞培養板，ddH2O 洗滌3 次備用，將干預后的各實驗組原代神經干細胞加入96 孔細胞培養板中（每孔100 μL），每孔約含10 000 個細胞。分別在OGD 損傷后12、24、48 和72 h 提前向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h 后，使用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度（A）值。RA 干預后，以A 值表示細胞增殖活性。采用GraphPad Prism 5.0 繪制各組細胞隨時間變化的增殖曲線；GSK-3β 抑制劑CHIR99021 干預后，按公式計算各組細胞增殖率。細胞增殖率＝（實驗孔A 值－空白孔A 值）/（對照孔A 值－空白孔A 值）×100%。

1.6 RT-qPCR 法檢測原代海馬神經干細胞中RARα、GSK-3β 和CyclinD1 mRNA 表達水平復糖復氧24 h 后提取原代神經干細胞總RNA 并測定RNA 濃度。將mRNA 分2 步逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存。將逆轉錄后的cDNA 行RT-qPCR 法檢測，試劑使用SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ，總反應體系為25 μL，所有操作均在冰上進行。PCR 循環條件：95 ℃變性10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，45 個循環；72 ℃、30 s。計算公式：以GAPDH 作為對照，閾值（Ct）為參數，采用2－ΔΔCt法計算mRNA相對表達水平，ΔΔCt=實驗組（Ct 目的基因－Ct 內參）－對照組（Ct 目的基因－Ct 內參）。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。引物名稱及序列 ：GAPDH 上游引物 5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游引物5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'；RARα上游引物5'-GACTCCGCTTTGGAATGG-3'，下游引物 5'-ACTGCTGCTCTGGGTCTCG-3'；GSK-3β 上游引物 5'-CATCCTTATCCCTCCTCACGCT-3'，下游引物5'-TATTGGTCTGTCCACGGTCTCC-3'；CyclinD1 上游引物 5'-TTCATCGAACACTTCCTCTCCA-3'，下游引物5'-GAGGGTGGGTTGGAAATGAA-3'。

1.7 Western blotting 法檢測原代海馬神經干細胞中RARα、GSK-3β 和CyclinD1 蛋白表達量復糖復氧24 h 后提取原代神經干細胞全蛋白并檢測蛋白濃度。各組取等量蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜和封閉。一抗RARα、GSK-3β、CyclinD1 和β-actin，4 ℃孵育過夜。次日TBST 洗滌4 次，每次5 min，加二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌4 次，每次5 min。用化學發光法處理后使用蛋白成像系統拍照。樣品均以β-actin 為對照。

1.8 統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖率，細胞中RARα、GSK-3β 和CyclinD1 mRNA 表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光鑒定大鼠原代海馬神經干細胞大鼠原代海馬神經干細胞在培養第3～4 天逐漸由單個細胞聚集成細胞團，細胞團成圓形或橢圓形，在顯微鏡下可以觀察到有的細胞團中間有小黑點（圖1A），可能的原因是細胞團體積過大導致中心細胞營養不良。采用Nestin 抗體鑒定原代海馬神經干細胞，綠色為其熒光色，通過免疫熒光鑒定，可以發現幾乎所有的原代海馬神經干細胞表達為綠色熒光（圖1B 和1C），表明提取的大鼠原代海馬神經干細胞純度較高。

圖1 大鼠原代海馬神經干細胞形態表現和鑒定（免疫熒光，×200）Fig.1 Morphology and identification of primary hippocampal neural stem cells of rats（Immunofluorescence,×200）

2.2 RA 干預后的各組大鼠原代海馬神經干細胞增殖活性OGD 損傷后細胞增殖檢測結果顯示：5.0 μmol·L－1RA 干預組在OGD 后各時間點細胞增殖活性最高（P＜0.05），而50.0 μmol·L－1RA 干預組在OGD 后各時間點細胞增殖活性最低（P＜0.05），且1.0 和5.0 μmol·L－1RA 干預組在OGD 后各時間點細胞增殖活性均高于單純OGD 組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞增殖活性Fig.2 Cell proliferation activities in various groups

2.3 RA 干預后各組細胞中RARα、CyclinD1 和GSK-3β mRNA 表達水平及蛋白表達量與OGD組比較，1.0、5.0 和10.0 μmol·L－1RA 干預組細胞中RARα 和GSK-3β mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），5.0和10.0 μmol·L－1RA 干預組細胞中CyclinD1 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05）。與對照組比較，OGD 組細胞中RARα、GSK-3β 和CyclinD1 蛋白表達量降低；與OGD 組比較，1.0、5.0 和10.0 μmol·L－1RA 干預組細胞中RARα 和GSK-3β 蛋白表達量升高。見圖3。

圖3 RA 干預后各組細胞中RARα、GSK-3β 和CyclinD1 mRNA 表達水平（A）和蛋白表達電泳圖(B)Fig.3 Expression levels of RAR α,GSK-3 β and CyclinD1 mRNA(A) and electrophoregram of expressions of proteins(B)in cells in various groups after RA intervention

2.4 GSK-3β 抑制劑CHIR99021 干預后各組細胞增殖率在OGD 后24 h 檢測不同濃度的GSK-3β抑制劑CHIR99021 對原代海馬神經干細胞的干預結果，圖4A 顯 示20 μmol·L－1CHIR99021 干預組細胞增殖率明顯低于OGD 組（P＜0.01），表明CHIR99021 抑制細胞增殖的有效濃度為20 μmol·L－1。圖4B 顯示5.0 μmol·L－1RA 干預組細胞增殖率明顯高于單純OGD 組（P＜0.01），而5.0 μmol·L－1RA+20 μmol·L－1CHIR99021 干 預組細胞增殖率明顯低于5.0 μmol·L－1RA 干預組（P＜0.01），表明加入GSK-3β 抑制劑CHIR99021后，5.0 μmol·L－1RA 促進OGD 后神經干細胞最優增殖的作用受到抑制。

圖4 各組細胞增殖率Fig.4 Cell proliferation rates in various groups

2.5 抑制劑CHIR99021 干預后各組細胞中RARα、GSK-3β 和CyclinD1 mRNA 表達水平及蛋白表達量與5.0 μmol·L－1RA 干預組比較，0 和0.5 μmol·L－1RA+20 μmol·L－1CHIR99021 干 預組細胞中RARα、GSK-3β 和CyclinD1 mRNA 表達水平均明顯降低（P＜0.01），5.0 和50.0 μmol·L－1RA+20 μ mol·L－1CHIR99021 干預組細胞中GSK-3β 和CyclinD1 mRNA 表達水平均明顯降低（P＜0.01）。與5.0 μmol·L－1RA 干預組比較，0～50.0 μmol·L－1RA+20 μmol·L－1CHIR99021干預組細胞中GSK-3β 和CyclinD1 蛋白表達量降低，RARα蛋白表達量變化不明顯。表明加入GSK-3β抑制劑CHIR99021后，適宜濃度（5.0 μmol·L－1）RA激活GSK-3β 和CyclinD1 的表達受到抑制，進而抑制細胞增殖。見圖5。

圖5 CHIR99021 干預后各組細胞中RARα、GSK-3β 和CyclinD1 mRNA 表達水平（A）和蛋白表達電泳圖(B)Fig.5 Expression levels of RARα,GSK-3β and CyclinD1 mRNA(A) and electrophoregram of expressions of proteins(B)in cells in various groups after CHIR99021 intervention

3 討論

近年來新生兒腦病患病率逐年升高，且致殘率和死亡率較高。因此，明確HIBD 的發病機制及修復機制，探索治療的新方法非常必要。促進神經細胞增殖再生是治療中樞神經系統損傷最有效的方法。目前已通過體外OGD 損傷培養的PC12 細胞，模擬體內神經細胞的缺氧缺血損傷，研究［12］結果顯示：OGD 損傷可抑制PC12 細胞增殖能力，適宜濃度RA 可促進PC12 細胞增殖。隨著維生素A 在疾病的應用研究日益增多，維生素A 有望成為HIBD 損傷后神經保護及治療的新手段。

維生素A 是一種脂溶性維生素，主要通過其活性代謝產物RA 在體內發揮作用。RA 作為一種重要的信號分子具有廣泛的生物學作用，通過RAR/RXR 異源二聚體或RXR/RXR 同源二聚體，與RA反應原件（RARE）結合直接或間接調控靶基因的轉錄和翻譯，可以調控多種組織和細胞的形態發生、增殖、生長發育和代謝等［13］。RA 在神經系統的發育中起著至關重要作用，可以調節神經細胞的凋亡、增殖和分化，神經軸突的生長和連接及神經管前后軸的形成等功能［14-15］。RA 信號過高或過低都會促進缺氧缺血性損傷誘導的細胞凋亡［16］。RA對損傷引起的神經元凋亡具有保護作用［17］。因此，可以推測凋亡的雙向調節取決于RA 濃度。但是，RA 濃度對神經干細胞增殖是否也具有雙向調節作用尚無相關報道。本研究采用不同濃度RA 干預OGD 損傷后的海馬神經干細胞，CCK8 法檢測結果表明：OGD 后1.0～5.0 μmol·L－1RA 干預海馬神經干細胞有助于細胞增殖，而50.0 μmol·L－1RA 干預導致細胞活性下降，可能高劑量的RA 具有細胞毒性或者抑制細胞增殖。本研究結合細胞中RARα、GSK-3β 和CyclinD1 mRNA 和蛋白表達結果顯示：1.0～10.0 μmol·L－1RA 可有效促進OGD損傷后神經干細胞增殖，且5.0 μmol·L－1RA 干預具有最佳細胞增殖效果，過高或過低濃度均可抑制OGD 損傷后神經干細胞增殖，表明RA 在缺氧缺血損傷的神經干細胞模型中存在適宜濃度治療窗（1.0～10.0 μmol·L－1）。因此，維持體內適宜水平的RA 對HIBD 后神經修復具有良好的促進作用。

RARα 是RA 的優勢表達受體［7］。前期研究［12］結果顯示：已發現RA 可通過RARα 調控PC12 細胞增殖。研究［10，18-19］表明：GSK-3β 信號通路參與損傷成年海馬神經新生過程、腦卒中及缺氧缺血腦損傷后的神經保護作用。因此目前越來越多的研究選擇GSK-3β 作為多種神經疾病的治療靶點。CyclinD1 的主要功能是調控細胞增殖。已有體外實驗研究［20-21］表明：敲除CyclinD1 基因可抑制海馬齒狀回中神經干細胞的增殖，并誘導NSCs 凋亡。而增加CyclinD1 基因表達時能夠促進神經干細胞和星形膠質細胞等神經細胞的增殖［11，22］。本研究結果顯示：與OGD 組比較，在5 μmol·L－1RA 干預下RARα、GSK-3β 和CyclinD1 的表達明顯升高。這一結果與本課題組前期在PC12 細胞中的研究結果［12］一致，提示適宜濃度RA 通過RARα 促進神經細胞增殖的機制與GSK-3β 和CyclinD1 有關。

盡管已有組織學實驗［23］顯示：RA 可以促進HIBD 損傷后新生鼠腦中內源性神經干細胞的增殖，但是RA 參與神經修復的作用機制仍不清楚。為了進一步探討RA 的作用機制，本研究選擇5.0 μmol·L－1RA 進行后續實驗，使用GSK-3β 抑制劑CHIR99021抑制GSK-3β活性。加入20 μmol·L－1CHIR99021 處理RA 干預后的海馬神經干細胞，細胞增殖檢測結果顯示：加入CHIR99021 處理后，適宜濃度（5.0 μmol·L－1）RA 促進OGD 損傷后海馬神經干細胞增殖的作用受到明顯抑制，細胞增殖活性降低，適宜濃度（5.0 μmol·L－1）RA 干預下GSK-3β 和CyclinD1 表達也受到抑制，再次驗證了適宜濃度RA 影響神經干細胞增殖的機制與RARα、GSK-3β 和CyclinD1 有關，并且抑制GSK-3β 活 性后，其下游CyclinD1 的轉錄受到明顯抑制。以上結果揭示了GSK-3β 信號是RA 調節OGD 后海馬神經干細胞增殖的重要信號。

綜上所述，本研究證明了RA 可促進缺氧后的神經干細胞增殖，且存在適宜濃度治療窗（1.0～10.0 μmol·L－1），推測RA 的作用機制可能主要通過激活GSK-3β 來調節下游CyclinD1 的轉錄，從而促進神經干細胞增殖。因此，適當劑量的維生素A可以作為HIBD 損傷后的臨床干預方法。