miR-762 通過(guò)靶向調(diào)控NCOR1 表達(dá)對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

唐乃高,鄭根建

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科,海南 海口 570100）

舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，由于舌體復(fù)雜的淋巴網(wǎng)絡(luò)和肌肉結(jié)構(gòu)，其具有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差，生存率低的特點(diǎn)［1-2］。尋找TSCC 進(jìn)展中的重要調(diào)控分子，對(duì)指導(dǎo)其早期診斷及靶向治療具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度為20～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA 分子，可作為腫瘤抑癌或致癌因子調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等過(guò)程［3］。既往研究［4-7］顯示：miR-762 在卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌和胰腺癌等組織中高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)；同時(shí)也有研究者在口腔鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-762 高表達(dá)［8］，然而miR-762 在人TSCC 組織中表達(dá)情況及其對(duì)TSCC發(fā)展的影響目前還未見(jiàn)報(bào)道。核受體輔助抑制因子1（nuclear receptor corepressor 1，NCOR1）是近些年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的因子，在前列腺癌［9］、非小細(xì)胞肺癌［10］和胃腸道間質(zhì)瘤［11］等腫瘤組織中低表達(dá)，并作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，然而NCOR1 在TSCC 組織中的表達(dá)及作用依然未知。為此，本研究通過(guò)檢測(cè)TSCC 組織中miR-762 和NCOR1 的表達(dá)水平并分析兩者表達(dá)水平的相關(guān)性，進(jìn)一步以體外培養(yǎng)的TSCC 細(xì)胞株為研究對(duì)象，探討miR-762 與NCOR1 的靶向關(guān)系以及對(duì)TSCC 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為T(mén)SCC 臨床診斷和治療提供新的分子標(biāo)志物和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源收集2016 年9 月—2019 年1 月于本院診治的TSCC 患者癌組織及其癌旁正常組織48 例（距離腫瘤邊緣≥2 cm），TNM 分期：Ⅰ期8 例、Ⅱ期10 例、Ⅲ期16 例和Ⅳ期14 例，其中男性28 例，女性20 例，年齡為15～72 歲，中位年齡44 歲，所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)確診，且術(shù)前均未接受放化療，均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器人正常舌上皮細(xì)胞Hacat 及人舌TSCC 細(xì)胞Tca-8113、CAL-27、SCC-15 和SCC-9 購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；miR-762 inhibitor 及其陰性對(duì)照 inhibitor-NC（scramble 序列）和NCOR1 干擾質(zhì)粒（si-NCOR1）及其陰性對(duì)照質(zhì)粒（si-NC）均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，LipofectamineTM2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，胎牛血清、MTT 檢測(cè)試劑盒、EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物研究所，雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR ）試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司，NCOR1、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-Caspase-3）、B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司，PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)于美國(guó)ABI 公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于法國(guó)巴德斯公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)所有細(xì)胞復(fù)蘇后按照說(shuō)明書(shū)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 細(xì)胞感染和分組處理取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL-27 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70% 時(shí)，采用LipofectamineTM2000 將miR-762 inhibitor 及其陰性對(duì)照inhibitor-NC 分別或同時(shí)與si-NCOR1 及其陰性對(duì)照質(zhì)粒si-NC 轉(zhuǎn)染至CAL-27 細(xì)胞中，分別命名為inhibitor-NC 組、miR-762 inhibitor 組、si-NC 組、si-NCOR1 組 和miR-762 inhibitor+si-NCOR1 組，另取不做任何處理的CAL-27 細(xì)胞作為空白對(duì)照組，孵育6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，收集轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞，采用RT-qPCR 和Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-762 與NCOR1 的靶向調(diào)控關(guān)系利用TargetScan 軟件（http：//www.targetscan.org/vert_71/）預(yù) 測(cè)miR-762 在NCOR1 3'-UTR 區(qū)域是否存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建NCOR1 野生型（WT）和突變型（MUT）熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，將其分別與miR-762 mimic 或miR-NC 共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對(duì)活性。

1.6 RT-qPCR 法檢測(cè)組織和細(xì)胞中miR-762 和NCOR1 mRNA 表達(dá)水平收集癌組織、癌旁組織及各細(xì)胞樣本，采用Trizol 法提取各樣本的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度。取2 μg總RNA 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。miR-762：正向引物5'-ACACGGGGCUGGGGCCGGGGCCGAGCGCCTC-3'，反向引物 5'-CTCAGGGGCUGGGGCCGGGGCCGAGCCAGA-3'；NCOR1：正向引物5'-CCCAGCAACGAGAGGAATCA-3'，反向引物 5'-GTCCATGGGAGGAGGCTTGT-3'；U6：正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH：正向引物5'-GTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3'，反向引物5'-ACCACCTTCTTGATGTCATCAT-3'。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6或GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計(jì)算組織和細(xì)胞中miR-762 及NCOR1 mRNA 表達(dá)水平。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中NCOR1 cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平收集各細(xì)胞樣本，加入適量裂解液于冰上充分裂解，4 ℃條件下12 000 r·min－1離心20 min，棄上清，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入NCOR1、cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2 和GAPDH 抗 體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，于暗室中顯影分析。以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.8 MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔2×103個(gè)細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48 和72 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT 溶液，37 ℃避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸掉上清，每孔加入150 μL DMSO 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處各孔的吸光度（A）值，以A（490）值表示細(xì)胞增殖活性。

1.9 EdU 法檢測(cè)各組細(xì)胞EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞率取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，分別接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，48 h 后加入含50 μmol EdU的培養(yǎng)基孵育12 h，棄掉培養(yǎng)液，PBS 緩沖液漂洗3 次，室溫下用冰甲醇固定細(xì)胞15 min，按照EdU 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，最后置于熒光顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選擇3 個(gè)視野，并計(jì)算EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞率。EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞率=EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，4 ℃條件下1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，PBS 緩沖液洗滌3 次，重懸細(xì)胞后加入5 μL Annexin Ⅴ和10 μ L 碘化丙啶，室溫避光孵育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖活性，組織和細(xì)胞中miR-762 和NCOR1 mRNA 表達(dá)水平，EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞率，NCOR1、cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 TSCC 組織和癌旁正常組織中miR-762 及NCOR1 mRNA 表達(dá)水平以及兩者表達(dá)水平的相關(guān)性與癌旁正常組織比較，TSCC 組織中miR-762表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），NCOR1 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示：TSCC 患者癌組織中miR-762 和NCOR1 mRNA 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=－0.711，P=0.003）。見(jiàn)圖1。

圖1 TSCC 組織及癌旁正常組織中miR-762 和NCOR1 mRNA 表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of miR-762 and NCOR1 mRNA in TSCC and paracancerous normal tissues

2.2 TSCC 細(xì)胞中miR-762 和NCOR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平與人正常舌上皮細(xì)胞Hacat 比較，人TSCC 細(xì)胞Tca-8113、CAL-27、SCC-15 和SCC-9 中miR-762 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），NCOR1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。選擇CAL-27 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖2 和表1。

表1 TSCC 細(xì)胞中miR-762 和NCOR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of miR-762 and NCOR1 mRNA and proteins in TSCC cells（n=3，）

表1 TSCC 細(xì)胞中miR-762 和NCOR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of miR-762 and NCOR1 mRNA and proteins in TSCC cells（n=3，）

*P＜0.01 compared with Hacat cells.

圖2 Western blotting 法檢測(cè)各種細(xì)胞中NCOR1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of NCOR1 proteins in various cells detected by Western blotting method

2.3 轉(zhuǎn)染miR-762 inhibitor 后CAL-27 細(xì)胞中miR-762 和NCOR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組和inhibitor-NC組比較，miR-762 inhibitor組細(xì)胞中miR-762 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），NCOR1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖3 和表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-762 inhibitor后各組CAL-27細(xì)胞中miR-762和NCOR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of miR-762 and NCOR1 mRNA and protein in CAL-27 cells after transfected with miR-762 inhibitor（n=3，）

表2 轉(zhuǎn)染miR-762 inhibitor后各組CAL-27細(xì)胞中miR-762和NCOR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of miR-762 and NCOR1 mRNA and protein in CAL-27 cells after transfected with miR-762 inhibitor（n=3，）

*P＜0.01 compared with blank control group；△P＜0.01 compared with inhibitor-NC group.

圖3 Western blotting 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-762 inhibitor后各組CAL-27 細(xì)胞中NCOR1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of NCOR1 protein in CAL-27 cells after transfected with miR-762 inhibitor in various groups detected by Western blotting method

2.4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-762 與NCOR1 的靶向調(diào)控關(guān)系TargetScan 軟件檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-762 在NCOR1 基因3'-UTR 區(qū)域存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：野生型細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mimic-NC 后熒光素酶活性（1.00±0.05）高于轉(zhuǎn)染miR-762 mimic（0.30±0.05）（P＜0.01）。而突變型細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mimic-NC 后（0.99±0.02）和miR-762 mimic 后（1.02±0.04）熒光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示NCOR1 是miR-762 的靶基因。

圖4 miR-762 與NCOR1 的靶向結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 Targeted binding sites of miR-762 and NCOR1

2.5 轉(zhuǎn)染si-NCOR1 后CAL-27 細(xì)胞中NCOR1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組和si-NC 組比較，si-NCOR1 組細(xì)胞中NCOR1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖5 和表3。

表3 各組CAL-27 細(xì)胞中NCOR1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of NCOR1 mRNA and protein in CAL-27 cells in various groups（n=3，）

表3 各組CAL-27 細(xì)胞中NCOR1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of NCOR1 mRNA and protein in CAL-27 cells in various groups（n=3，）

*P＜0.01 compared with blank control group；△P＜0.01 compared with si-NC group.

圖5 Western blotting 法檢測(cè)各組CAL-27 細(xì)胞中NCOR1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of NCOR1 protein in CAL-27 cells in various groups detected by Western blotting method

2.6 各組細(xì)胞增殖活性和EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞率空白對(duì)照組、inhibitor-NC、miR-762 inhibitor、si-NC、si-NCOR1 和miR-762 inhibitor+si-NCOR1組EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞率分別為（44.23±3.05）%、（45.60±5.25）%、（26.29±3.26）%、（46.94±5.20）%、（64.33±3.18）%和（37.47±6.11）%，與空白對(duì)照組和inhibitor-NC 組比較，miR-762 inhibitor 組細(xì)胞增殖活性和EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞率明顯降低（P＜0.01）；與空白對(duì)照組和si-NC 組比較，si-NCOR1 組細(xì)胞增殖活性和EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高（P＜0.01）；與miR-762 inhibitor 組比較，miR-762 inhibitor+si-NCOR1 組細(xì)胞增殖活性和EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)表4 和圖6。

圖6 各組細(xì)胞EdU 染色結(jié)果（×200）Fig.6 Results of EdU staining of cells in various groups (×200)

表4 各組細(xì)胞增殖活性Tab.4 Proliferation activities of cells in various groups（n=3，）

表4 各組細(xì)胞增殖活性Tab.4 Proliferation activities of cells in various groups（n=3，）

*P＜0.01 compared with blank control group；△P＜0.01 compared with inhibitor-NC group；#P＜0.01 compared with si-NC group；▲P＜0.01 compared with miR-762 inhibitor group.

2.7 各組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平及各組細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組、inhibitor-NC 組、miR-762 inhibitor 組、si-NC 組、si-NCOR1 組 和miR-762 inhibitor+si-NCOR1 組細(xì)胞凋亡率分別為（3.15±0.42）%、（3.22±0.36）%、（72.09±3.37）%、（3.55±0.36）%、（1.23±0.10）%和（58.05±4.32）%。與空白對(duì)照組和inhibitor-NC 組比較，miR-762 inhibitor 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；細(xì)胞中cleaved-Caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與空白對(duì)照組和si-NC 組比較，si-NCOR1 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01），細(xì)胞中cleaved-Caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與miR-762 inhibitor 組比較，miR-762 inhibitor+si-NCOR1 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)cleaved-Caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖7、圖8 和表5。

表5 各組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of cleaved-Caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins in cells in various groups（n=3，）

表5 各組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of cleaved-Caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins in cells in various groups（n=3，）

*P＜0.01 compared with blank control group；△P＜0.01 compared with inhibitor-NC group；#P＜0.01 compared with si-NC group；▲P＜0.01 compared with miR-762 inhibitor group.

圖7 各組細(xì)胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of cells in various groups

圖8 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.8 Electrophoregram of expressions of cleaved-Caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討論

人體有超過(guò)60%的蛋白質(zhì)編碼基因上都具有miRNAs 的結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和遷移過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用，還可以通過(guò)調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展［12］。有多種miRNA 參與了TSCC 的發(fā)生進(jìn)程［13-14］，miR-762 被證實(shí)在多種腫瘤組織中高表達(dá)［4-8］，但關(guān)于其在TSCC 中的表達(dá)情況和作用卻未見(jiàn)報(bào)道。NCOR1 是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤組織中低表達(dá)，但未見(jiàn)其在TSCC 中的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：在TSCC 組織及TSCC 細(xì)胞中miR-762 的表達(dá)水平明顯高于其在對(duì)應(yīng)的癌旁組織及正常舌上皮細(xì)胞中的表達(dá)，而NCOR1 在TSCC 組織及TSCC 細(xì)胞中mRNA 表達(dá)水平明顯低于其在對(duì)應(yīng)的癌旁組織及正常舌上皮細(xì)胞中的表達(dá)，且Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示在TSCC 組織中miR-762 與NCOR1 mRNA 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-762 和NCOR1 可能為T(mén)SCC 的差異基因。通過(guò)TargetScan 軟件檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-762 基因序列上存在NCOR1 的結(jié)合位點(diǎn)，并進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的靶向關(guān)系。

研究［15-16］顯示：NCOR1 在膀胱癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)。而對(duì)NCOR1 基因進(jìn)行miRNA 干擾可以提高基因的調(diào)節(jié)能力，有效地降低增殖反應(yīng)。為明確miR-762 和NCOR1 在TSCC 中的具體作用，本研究選擇TSCC 細(xì)胞CAL-27 作為研究對(duì)象，通過(guò)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-762 inhibitor 或si-NCOR1 來(lái)抑制細(xì)胞中miR-762 或NCOR1 的表達(dá)，觀察其對(duì)TSCC 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-762 inhibitor 明顯上調(diào)了CAL-27 細(xì)胞中的NCOR1 蛋白表達(dá)，同時(shí)，抑制miR-762 表達(dá)能明顯抑制CAL-27 細(xì)胞增殖，而抑制NCOR1 表達(dá)能促進(jìn)CAL-27 細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制miR-762 和NCOR1 表達(dá)能減弱miR-762 對(duì)CAL-27 細(xì)胞增殖的抑制作用，說(shuō)明miR-762 能負(fù)向靶向NCOR1，miR-762 抑制TSCC 細(xì)胞的增殖作用與靶向上調(diào)NCOR1 表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡，通過(guò)內(nèi)源性與外源性2 種獨(dú)立的通路調(diào)控［17-18］，其中線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性通路與Bax、Bcl-2 和Caspase-3 等蛋白有密切關(guān)聯(lián)：抗凋亡蛋白Bcl-2 通過(guò)抑制細(xì)胞色素C 的釋放維持線粒體外膜完整性，促凋亡蛋白Bax 通過(guò)增加線粒體外膜的通透性促進(jìn)細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而Caspase-3 是細(xì)胞凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的下游關(guān)鍵蛋白，當(dāng)Bcl-2/Bax 表達(dá)失衡，Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，細(xì)胞凋亡程序便會(huì)啟動(dòng)［19-20］。本研究結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，miR-762 inhibitor 組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)cleaved-Caspase-3 及Bax 蛋白水平明顯升高，Bcl-2 蛋白水平明顯下調(diào)；而si-NCOR1 組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)cleaved-Caspase-3 及Bax 蛋白水平明顯下降，Bcl-2蛋白水平明顯升高；與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-762 inhibitor比較，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-762 inhibitor 和si-NCOR1 后細(xì)胞凋亡率下降，說(shuō)明NCOR1 下調(diào)能夠回補(bǔ)miR-762 對(duì)CAL-27 細(xì)胞的抑制作用。

綜上所述，miR-762 在TSCC 組織和細(xì)胞中高表達(dá)，NCOR1 在TSCC 組織和細(xì)胞中低表達(dá)，抑制miR-762 表達(dá)能通過(guò)靶向上調(diào)NCOR1 表達(dá)抑制TSCC 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-762 可能成為T(mén)SCC 的一種新的診斷分子標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)。