肉桂醛抗菌粘接劑的制備及其抗菌性能評價

王 晗,田子璐,朱軒言,楊宇斌,朱 松

（吉林大學口腔醫院修復科，吉林 長春 130021）

光固化復合樹脂因其具有良好的美觀性、生物相容性以及力學性能，已成為臨床應用最廣泛的牙體充填修復材料［1］。繼發齲是更換復合樹脂修復體的最常見原因（43%）［2］。為防止繼發齲的發生，對粘接劑進行改性，賦予其抗菌、抗蛋白質吸附和促礦化等功能［3-5］，是一種行之有效的方法。其中，具有抗菌功能的粘接劑可以抑制粘接界面生物膜的生長，直接消除繼發齲發生的生物因素，大量的研究［6-9］已經證明此種方法的有效性。目前研究開發的抗菌粘接劑，根據其作用機制的不同，分為釋放型抗菌粘接劑和非釋放型抗菌粘接劑［10］，前者以納米銀等金屬離子、金屬氧化物、抗生素類和氯己定等小分子抗菌劑為代表，非釋放型抗菌劑以季銨鹽化合物和三氯生衍生物等抗菌單體為代表。但上述抗菌劑存在易改變粘接劑的顏色、生物安全性低和可能誘導細菌產生耐藥性等缺點。

肉桂醛（cinnamaldehyde）是肉桂樹皮精油的主要成分，也是肉桂藥理作用的主要來源，作為一種小分子有機化合物，其分子結構包括苯環、雙鍵和醛基官能團，性狀為淡黃色的黏稠油狀液體［11］。作為一種天然的廣譜抗菌劑，因其優越的抗菌性能和較高的生物安全性，已被廣泛應用于食品添加劑、食品包裝和化妝品防腐等領域，對導致人類傳染病、食品或化妝品降解的革蘭陽性細菌和革蘭陰性細菌均有較強的抗菌活性［12］。但目前肉桂醛在口腔醫學領域的應用，仍以肉桂精油的形式添加在牙膏和漱口水等口腔護理產品中的方式為主，尚無將肉桂醛從肉桂精油中分離并應用于牙本質粘接劑的研究。

本實驗選取肉桂醛這一天然抗菌劑，首先檢測其抗菌性能，然后將其按一定比例加入現有的商品牙本質粘接劑中，測定粘接劑的抗菌性能，同時探討肉桂醛的加入對粘接劑的體外細胞毒性和粘接強度的影響，以確定含肉桂醛的抗菌粘接劑是否能夠滿足臨床應用需求，以期減少繼發齲的發生，延長復合樹脂充填修復體的使用壽命。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

變異鏈球菌（S.mutanUA159）（美國ATCC公司），小鼠成纖維細胞（吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室提供），人離體牙（吉林大學口腔醫院提供）。肉桂醛（分析標準品＞99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），牙本質粘接劑Single Bond 2（SB2）和復合樹脂Z350（美國3M 公司），腦心浸液肉湯培養基（brain-heartinfusion，BHI）和腦心浸液瓊脂培養基（青島高科園海博生物技術有限公司），活/死細菌熒光試劑盒（美國Molecular Probes 公司），H-DMEM 高糖培養基和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（南京建成生物有限公司），MTT 試劑（美國Sigma 公司），胎牛血清和胰蛋白酶（美國Gbico公司），格魯瑪酸蝕劑37%磷酸凝膠（德國Heraeus Kulzer GmbH 公司）。細胞培養瓶、6 孔細胞培養板和96 孔細胞培養板（美國Costar 公司），高級超凈臺（型號BLB-1300，蘇州蘇凈安泰空氣技術有限公司），高速離心機（美國Beckman coulter 公司），倒置顯微鏡（日本Olympus 公司），CO2恒溫細胞培養箱（日本Sanyo 公司），冰箱（型號BCD-221TMCV，海爾集團），酶標儀（型號BL340，美國Biotech 公司），37 ℃恒溫孵育箱（型號SLI-1200，日本Sanyo 公司），厭氧培養罐，可見光分光光度計（型號LAMBDA 25，美國Perkin Elmer公司），speedmixer 高速混合機（美國Hauschild 公司），萬能試驗機（型號AG-X plus，日本Shimadzu公司），藍光光固化燈（型號SLC-VIIIA，桂林維潤醫療科技有限公司）。

1.2 肉桂醛最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）測定

1.2.1 肉桂醛溶液配制 肉桂醛標準品40 mg 加入200 μL 無水乙醇溶解，4 ℃密封保存備用。

1.2.2 細菌培養 將凍干變異鏈球菌菌株復蘇并接種于BHI 瓊脂平板，孵箱37 ℃厭氧培養48 h，形態學及生化實驗鑒定為純培養物后，將其接種于BHI 瓊脂平板傳至第3 代。用接種環挑取單個菌落接種于4 mL BHI 液體培養基中，厭氧環境下培養24 h 后，用移液槍吹打均勻后取2 mL 菌懸液進行比濁，根據比濁結果將剩余的2 mL 菌懸液濃度稀釋至1×106CFU·mL－1，備用。

1.2.3 微量肉湯稀釋法測定肉桂醛的MIC 和MBC 將120 μL 肉桂醛無水乙醇溶液加入3 mL BHI 液體培養基中，得到藥物濃度為8 000 mg·L－1的第一組藥物，二倍稀釋法依次稀釋為8 000、4 000、2 000、1 000、500、250 和125 mg·L－1，另將120 μL 無水乙醇加入3 mL BHI 溶液中，作為溶劑對照組。

取96 孔細胞培養板，每孔加入100 μL 菌液，而后各孔依次加入100 μL 藥物，并設置BHI 培養基對照組、溶劑對照組和細菌生長對照組。孵箱37 ℃厭氧培養24 h，取出后，肉眼觀察細菌生長情況，并用酶聯免疫檢測儀于600 nm 波長處測定吸光度（A）值，選擇無細菌生長的藥物濃度最低組為MIC，單位為mg·L－1。在1/2 MIC 組及以上的各孔取10 μL 液體，涂布于BHI 瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養48 h，觀察無菌落生長的最低藥物濃度即為MBC，單位為mg·L－1。

1.3 肉桂醛抗菌粘接劑的抗菌性能檢測

1.3.1 肉桂醛抗菌粘接劑的制備 分別以質量分數2%、4%、6% 和8% 的肉桂醛與商品粘接劑SB2 混合，對照組為未加入肉桂醛的SB2。使用speedmixer 高速混合機進行混合，3 000 r·min－1混合20 s，避光保存。將配置好的抗菌性粘接劑置于長方形聚四氟乙烯模具（長度2 cm，寬度1 cm）中，為防止氧阻聚層，表面覆蓋聚乙烯薄膜，光照固化，每個點照射20 s，重疊照射。將制備的長方形試樣在超凈臺內，紫外光消毒殺菌2 h，待用。

1.3.2 細菌黏附實驗 將消毒后的試件（n=5）放入已滅菌處理的離心管中，加入2.5 mL 菌液沒過試件，孵箱37 ℃厭氧培養48 h 后取出，用PBS緩沖液輕輕沖洗去除雜質及表面未黏附的細菌，然后轉移至新的離心管中，每管加入5 mL PBS 緩沖液，超聲震蕩10 min，吹打均勻，梯度稀釋100 倍，取50 μL 涂布于BHI 瓊脂平板，孵箱37 ℃厭氧培養48 h 后取出，行菌落計數并計算抗菌率（%）。抗菌率計算公式：抗菌率=（B－A）/B×100%，A 為實驗組試件平均回收菌落數（cfu），B 為對照組試件平均回收菌落數（cfu）。

1.3.3 活/死細菌染色實驗 細菌的培養如“1.3.2”，PBS 緩沖液沖洗過的試件轉移至6 孔細胞培養板中，采用活/死細菌熒光試劑盒進行染色。在熒光顯微鏡下，活細菌染色后會產生綠色熒光；細胞膜受損的細菌則會被含碘的試劑染色，產生紅色熒光；而接近或重疊的活/死細菌會顯示出橙和黃色。

1.4 體外細胞毒性實驗

1.4.1 浸提液制備和處理 將配置好的抗菌性粘接劑置于長方形聚四氟乙烯模具（長度2 cm，寬度1.5 cm）中，為防止氧阻聚層，表面覆蓋聚乙烯薄膜，光照固化，每個點照射20 s，重疊照射。將制備的長方形試樣在超凈臺內，紫外光消毒殺菌2 h，每個試件用2 mL 含10%胎牛血清的高糖細胞培養基37 ℃浸提24 h，過濾除菌，4 ℃密封保存備用。

1.4.2 MTT 實驗 選擇小鼠成纖維細胞（L929）作為實驗用細胞檢測粘接劑細胞毒性，37 ℃CO2恒溫細胞培養箱（5% CO2、95%濕度）中培養至對數生長期鋪于96 孔細胞培養板，每孔2 000 個細胞，每組6 個復孔，另設細胞生長對照組。浸提液用含10%胎牛血清的培養基分別稀釋1 000、2 000和4 000 倍，培養24 h 后棄去原培養液，實驗組每孔加入200 μL 粘接劑浸提液，細胞生長對照組更換200 μ L 細胞培養液，繼續培養24 h。每孔加入20 μL MTT 溶液，孵育4 h 后棄去浸提液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），震蕩后用酶聯免疫檢測儀于540 nm 波長處測定A 值。計算細胞生存率（cell viability，%），并獲得對應的細胞毒性等級。體外細胞毒評價等級標準：0 級（細胞生存率≥100%），1 級（75%≤細胞生存率＜100%），2 級（50%≤細胞生存率＜75%），3 級（25%≤細胞生存率＜50%），4 級（0%＜細胞生存率＜25%），5 級（細胞生存率=0）。細胞生存率計算公式：細胞生存率=實驗組A 值/對照組A 值×100%。

1.5 即刻粘接強度測試

1.5.1 離體牙的保存和處理 選擇微拉伸試驗檢測粘接劑的粘接強度。收集完整的12 顆新鮮離體牙，由吉林大學口腔醫院提供，患者簽署知情同意書。離體牙浸泡于0.5%氯銨T 溶液中4 ℃保存備用。采用慢速鋸將離體牙的冠部牙釉質磨除，暴露牙本質，分別用180 目、360 目和600 目的砂紙在流水狀態下打磨15 s，模擬玷污層。

1.5.2 微拉伸試件的制備 按照粘接劑SB2 的使用說明書進行操作：37%磷酸凝膠酸蝕15 s，沖洗10 s，涂布粘接劑15 s，輕吹5 s，光照固化10 s。粘接劑固化后分層堆砌復合樹脂Z350，每層2 mm，光照40 s 固化，堆砌2 層。將制備的微拉伸離體牙試樣浸泡于37 ℃去離子水中24 h，采用慢速鋸沿牙體長軸，垂直于粘接界面將其切割成截面積為1 mm × 1 mm 的長條狀試樣，每顆牙留取界面中間部位的4 個試樣。

1.5.3 微拉伸強度檢測 使用萬能試驗機進行微拉伸強度測試，拉伸速率設置為1 mm·min－1，微拉伸強度（單位為MPa）計算公式：微拉伸強度=斷裂點最大載荷（Fmax，單位為N）/斷裂點截面面積（mm2）。

1.6 統計學分析

采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。試件平均回收菌落數和粘接劑微拉伸強度均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肉桂醛的MIC 和MBC

肉桂醛濃度上升至250 mg·L－1時細菌未生長，選取此濃度作為肉桂醛的MIC。取細菌生長對照組，1/2 MIC即125 mg·L－1及以上各組涂板，對照組和125 mg·L－1組平板上細菌生長，而250 mg·L－1及以上肉桂醛組細菌未生長，250 mg·L－1為肉桂醛的MBC。

2.2 肉桂醛抗菌粘接劑的抗菌性能

2.2.1 各組粘接劑表面黏附細菌菌落計數和粘接劑抗菌率 各組粘接劑表面黏附細菌菌落計數以及抗菌率見表1。與對照組比較，質量分數2%、4%、6%和8%肉桂醛組菌落計數明顯降低（P＜0.05）；與質量分數2%肉桂醛組比較，質量分數4%、6%和8%肉桂醛組菌落計數明顯降低（P＜0.05）；4%、6%和8%肉桂醛組菌落計數抗菌率均高于99%，表明粘接劑具有明顯的抗菌效果。

表1 各組粘接劑菌落計數和抗菌率Tab.1 Colony counting and antibacterials rates of adhesive in various groups（n=5）

2.2.2 試件表面活/死細菌染色形態 各組的活/死細菌染色實驗結果顯示：隨著粘接劑中肉桂醛含量的逐漸升高，試件表面黏附的細菌總量明顯減少，且細菌染色逐漸由綠色變為橙色和紅色，表明活菌數量明顯降低。見圖1。

圖1 試件表面活/死細菌染色形態圖(Bar=100 μm)Fig.1 Morphology of live/dead bacterial staining on surface of specimens(Bar=100 μm)

2.3 各組肉桂醛抗菌粘接劑體外細胞毒性實驗

各組肉桂醛粘接劑體外細胞毒性實驗結果以細胞毒性等級表示。與對照組比較，相同稀釋倍數下抗菌粘接劑細胞毒性等級均無明顯變化。見表2。

表2 各組粘接劑細胞生存率和細胞毒性等級Tab.2 Cell survival rates and cytotoxicity grades of adhesives in various groups

2.4 各組抗菌粘接劑微拉伸強度

微拉伸實驗，與對照組（29.09 MPa±9.55 MPa）比較，質量分數4%、6%和8%肉桂醛組的微拉伸強度［（26.55 MPa±3.63 MPa）、（27.89 MPa±5.92 MPa）和（20.33 MPa±2.35 MPa）］差 異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

為預防繼發齲的發生，在牙本質粘接劑中加入抗菌劑的嘗試已被證實其有效性，其中可光固化的季銨鹽類單體已應用于商品粘接劑中［13］。被選擇的抗菌劑除考慮抗菌性能外，其細胞毒性、是否容易誘導細菌產生耐藥性、是否影響粘接劑單體聚合及粘接體系的粘接性能均是需要考慮的因素。

目前文獻報道的抗菌劑，常見的包括銀離子、金屬氧化物［14］、抗生素［8］、抗菌肽［1］、氯己定、三氯生及衍生物、殼聚糖［7］和季銨鹽化合物等多種類型，抗菌劑添加方式包括直接添加和載體負載等［15］。銀離子類在應用中常采用納米銀的形式，抗菌性較強，可持續作用，但由于其重金屬離子的屬性，會導致粘接劑顏色變黑，影響修復美觀效果，細胞毒性也較強；季銨鹽化合物為接觸性抗菌劑，抗菌性能與其碳鏈長度有關聯，因其結構中含有雙鍵，可與粘接劑單體聚合發揮持久抗菌作用，對粘接劑的粘接性能影響也較小，因而受到廣泛關注［13］，但細菌對季銨鹽化合物易產生耐藥性，長期應用的效果尚待研究；氯己定［6］和三氯生［16］等小分子抗菌劑，抗菌性能優良，所需添加比例不高，但也存在生物安全性和細菌耐藥性等方面的不足。

本實驗選擇的抗菌劑肉桂醛，作為食品和化妝品中常用的防腐劑，具有較高的生物安全性，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）將肉桂醛認定為安全性添加劑［17］。我國《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》（GB2760-2014）中也將肉桂醛批準為可在食品中使用的天然防腐劑［18］。肉桂醛作為肉桂精油的主要有效成分，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有較強的廣譜抗菌作用，包括大腸桿菌［19］、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜肺軍團菌、變形桿菌和李斯特菌等［12］。肉桂醛對口腔內的常見菌及致病菌，如變異鏈球菌、遠緣鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌和嗜酸乳桿菌等也具有較強的抗菌性能［20］。

對肉桂醛抗菌作用機制的相關研究［17］顯示：肉桂醛可抑制細菌細胞壁生物合成、膜功能和特異性酶活性，是其具有抗菌活性的主要原因：致死濃度肉桂醛會破壞細胞膜；較高但亞致死濃度肉桂醛為ATP 酶抑制劑；極低濃度的肉桂醛可以抑制參與細胞因子相互作用的酶。肉桂醛能夠滲透進入細菌細胞內部，與細菌DNA 發生相互作用，影響DNA 的正常合成［21］，而且能夠改變細菌內部的離子平衡（Ca2+、K+和H+等），從而導致細菌死亡［22］。

本研究以MIC 和MBC 作為觀察指標，檢測肉桂醛對變異鏈球菌的抗菌性能。MIC 指的是肉眼不能看到細菌生長的最小藥物濃度，MBC 定義為藥物能殺滅99.9%細菌的最低濃度［23］，二者能夠反映藥物的抗菌活性。本研究中，MIC 對變異鏈球菌的MIC 為250 mg·L－1，MBC 與MIC 相同。與其他抗菌劑比較，氟化鈉對變異鏈球菌的MIC 為125 mg·L－1，MBC 為250 mg·L－1；氯己定對變異鏈球菌的MIC為30 mg·L－1，MBC為240 mg·L－1［24］；而其他植物天然抗菌劑的MIC 和MBC 一般均高于肉桂醛，如茶樹精油對變異鏈球菌的MIC 為0.125%（體積分數），MBC 為0.25%（體積分數）［25］；咖啡提取物對變異鏈球菌 的MIC 為62.5 g·L－1，MBC 為125 g·L－1［26］；紅色蜂膠提取物對變異鏈球菌 的MIC為293 mg·L－1，MBC為1 172 mg·L－1［27］。與常見的天然抗菌劑比較，肉桂醛的抗菌效果十分明顯；肉桂醛與口腔醫學領域常用的防齲抗菌劑氟化鈉和氯己定的抗菌性能相近或略低。

抗菌粘接劑的制備，采用高速攪拌機將肉桂醛與粘接劑均勻混合的物理混合方式。因商品粘接劑具有穩定的特性，且已廣泛應用于臨床，因此選擇全酸蝕粘接劑SB2 作為原料和對照組。肉桂醛分子結構中所含雙鍵與粘接劑單體中的酯雙鍵性質不同，理論上二者不能發生聚合反應。前期研究結果［7，28］顯示：能產生有效抗菌作用的三氯生殼聚糖在粘接劑中添加的質量分數為5%，抗菌單體甲基丙烯酰乙基十六烷基二甲基氯化銨在粘接劑中的有效濃度為3%（質量分數）。本實驗中，細菌黏附實驗菌落計數和抗菌率的結果均表明：在肉桂醛的質量分數為4%或以上時，抗菌率超過99%，即粘接劑有顯著的抗菌效果。活/死細菌染色實驗檢測結果也顯示：隨著粘接劑中肉桂醛含量的逐漸升高，試件表面黏附的細菌總量以及活菌數量均明顯降低，粘接劑對于細菌的黏附和材料表面黏附細菌的存活都有較強的抑制作用。

因MTT 法具有操作比較簡單，良好的重復性，靈敏度相對較高，檢測時間短，且經濟適用性好等諸多優點，故將其應用于體外細胞毒性實驗。在生物安全性檢測方面，國內外學者對MTT 法的檢測結果認可度較高。作為原材料的商品粘接劑本身有一定的細胞毒性，可能由部分粘接劑單體未固化導致。本實驗采用GONG 等［29］的粘接劑細胞毒性檢測方法，因對照組SB2 是在臨床中已廣泛應用的商品粘接劑，故以SB2 的體外細胞毒性為標準，判定肉桂醛的加入是否影響粘接劑的體外細胞毒性等級。本實驗中，將肉桂醛加入商品粘接劑后，各組細胞生存率均高于70%，毒性等級低于2 級，與商品粘接劑SB2 比較，體外細胞毒性并未提高，甚至在稀釋倍數較大的情況下對L929 細胞的生長發揮一定的促進作用。

粘接性能是牙本質粘接劑的基本性能，對粘接劑的改性，應以不降低其粘接強度為前提。微拉伸實驗是檢測牙本質粘接劑微拉伸性能最常用也是最直觀的實驗方法，但實驗過程中需要用到人離體牙，且操作步驟復雜。本次抗菌實驗中，已經篩選出2%肉桂醛組的抗菌效果不夠理想，故在本實驗中將其去掉。本研究結果顯示：肉桂醛的加入，在為粘接劑提供抗菌性能的前提下未對其微拉伸強度產生明顯不利影響。從粘接強度的實驗結果推斷，肉桂醛的加入對粘接劑的光敏感性以及雙鍵轉化率影響不明顯，對以上表征的定量分析有待后續實驗驗證。

綜上所述，為抑制樹脂直接充填修復后繼發齲的發生，本研究在檢測了抗菌劑肉桂醛抗菌性能的基礎上，將其引入牙本質粘接系統，制備了含肉桂醛的抗菌粘接劑，并進行了抗菌性能、體外細胞毒性和粘接性能的檢測，實驗結果表明：肉桂醛在粘接劑中的質量分數達4%時，能夠發揮明顯的抗菌作用，同時體外細胞毒性和粘接性能無明顯降低。考慮到抗菌劑比例的升高有可能對粘接劑的粘接性能和體外細胞毒性等方面產生影響，應在保證粘接劑抗菌性能的基礎上，盡量降低抗菌劑的比例，因此，本實驗選擇質量分數4%作為肉桂醛的最佳添加比例。本實驗的研究結果為抗菌牙本質粘接劑的研究提供了新思路。