沒食子酸對M1 型巨噬細胞極化的影響

毛赫新 ,王琳源 ,關 寧 ,高秀秋

（1.錦州醫科大學附屬第二醫院牙周黏膜科，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫科大學附屬第一醫院腦與脊髓損傷重點實驗室，遼寧 錦州 121000）

巨噬細胞作為固有免疫應答的重要組成部分，在宿主免疫中占有重要地位，其功能主要表現在識別、吞噬和清除外來病原體及異物等［1］。巨噬細胞具有可塑性，在不同微環境下可分化為不同細胞亞型。巨噬細胞在白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的作用下可分化為M1 型巨噬細胞，產生高水平的誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和信號轉導與轉錄激活因子1（signal transducerand activator of transcription 1，STAT1）［2-3］，分泌大量腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等炎性細胞因子，并產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）參與病毒性心肌炎、骨關節炎和感染性腸胃炎等炎癥性疾病的發病過程［4-5］。沒食子酸（gallic acid，GA）是一類天然的多酚類化合物，其化學名為3，4，5-三羥基苯甲酸，GA 在抑菌、抗炎、防過敏、抗腫瘤和抵御氧化等方面具有良好的治療效果，在免疫細胞分化、活化和維持免疫系統的穩定過程中也發揮著多種功能［6-8］。近年來，研究［9-10］表明：GA 可通過影響巨噬細胞相關因子的表達而發揮抗炎作用，然而有關GA 對巨噬細胞極化的研究尚未見相關文獻報道。本實驗通過在體外建立M1 型巨噬細胞極化模型，利用GA 干預M1 型巨噬細胞極化過程，明確GA 對M1 型巨噬細胞極化的影響，為以M1 型巨噬細胞為靶向的免疫調控提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器8 周齡、體質量約20 g 的SPF 級C57BL/6 小鼠，購自遼寧長生生物技術有限公司，動物使用許可證號：SYXK（遼）2019-0007。正常膳食喂養，光照周期為12 h∶12 h，按照《實驗動物許可管理辦法》和《實驗動物管理條例》 的相關規定進行實驗。GA 購自美國TargetMol 公 司，RPMI 1640 培養基和胎牛血清購自美國Invitrogen 公司，F4/80 抗體和iNOS 抗體購自美國Cell Signaling 公司，Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 細胞凋亡檢測試劑盒和反轉錄試劑盒購自中國Vazyme 公司，TRIzol 購自美國Ambion 公司，iNOS、β-actin 和IL-1β 引物購自北京鼎國昌盛生物有限公司。流式細胞儀購自美國BD 公司，實體顯微鏡購自日本Olympus 公司，實時熒光定量 PCR（Real-time fluorescence quatitative PCR，RT-qPCR）儀和高速低溫離心機購自美國Thermo 公司，渦旋混合器購自江蘇省其林貝爾儀器制造廠，電子天平購自北京市賽多利斯天平有限公司，迷你離心機購自北京昊諾斯生物公司，微量加樣器購自法國吉爾森公司。

1.2 小鼠腹腔巨噬細胞的提取取8 周齡C57BL/6 雌性小鼠，灌洗腹腔收集腹腔液，收集細胞沉淀并重懸，臺盼藍拒染法計數活細胞大于95%，采用RPMI 1640 完全培養基（含10% 胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素）調整細胞濃度，以每孔3.5×105個細胞數接種于96 孔細胞培養板中，置于細胞培養箱中培養2 h 后，差速貼壁法去除未貼壁細胞，收集得到貼壁的小鼠腹腔巨噬細胞［11］。

1.3 實驗分組和處理方法將原代培養腹腔巨噬細胞隨機分為對照組、M1 極化模型組和GA 組，每組設置3 個復孔。對照組中加入等體積的培養液；M1 極化模 型組用 100 μg·L－1脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和20 μg·L－1IFN-γ 共同刺激細胞24 h 誘導腹腔巨噬細胞向M1 型極化；GA 組用37.5 mg·L－1GA 與LPS 和IFN-γ 共同處理腹腔巨噬細胞24 h。

1.4 倒置顯微鏡觀察各組細胞形態表現細胞分組同上，細胞培養24 h 后，倒置顯微鏡（×400）觀察各組細胞形態表現。

1.5 AnnexinⅤ-PE/7-AAD 雙染法檢測各組細胞凋亡率嚴格按照說明書操作將各組細胞樣本制成濃度為1×106mL－1單細胞懸液，吸取100 μL 重懸液到流式管中，加入5 μL Annexin Ⅴ-PE 和5 μ L 7-AAD Staining Solution，吹勻，避光、室溫孵育10 min，加 入400 μ L 1× Binding Buffer，混 勻，1 h 內用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，采用FlowJo 7.6.1 軟件進行數據分析，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數）/細胞總數×100%，實驗重復3 次。

1.6 流式細胞術檢測M1 型巨噬細胞陽性表達率將各組細胞懸液分別以每管1×106個細胞加入流式管并根據組別進行編號。用FITC 標記的F4/80 抗體以及相應的同型對照抗體進行胞外因子染色，用PE 標記的iNOS 抗體以及相應的同型對照抗體進行胞內因子染色，350 μL Staining Buffer 洗滌重懸，立即上機檢測。以前向散射角和側向散射角確定巨噬細胞群，采用 FlowJo 7.6.1 軟件分析F4/80+iNOS+M1 型巨噬細胞占比，即陽性表達率，實驗重復3 次。

1.7 RT-qPCR 法檢測各組細胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表達提取細胞的總RNA 反轉錄合成cDNA，擴增。按照試劑盒的步驟進行實驗操作。每孔依次加入2 μ L cDNA、10 μL 2×mix、3'和5'端引物各0.4 μL，無菌水7.2 μL。ABI7900 型PCR 儀進行反應，每組3 個平行樣品。引物序列：iNOS，上游引物5'-GGGTCACAACTTTACAGGGAGT-3'，下游引物5'-GAGTGAACAAGACCCAAGCG-3'；IL-1β，上游引物5'-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3'，下游引物 5'-TGTGCTGCGAGATTTGA-3' ；β-actin上游引物5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，下游引物5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。引物均由北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成。反應條件：預變性95 ℃、30 s；循環反應95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 個循環；熔解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。以β-actin為內參，采 用2－ΔΔCt值表示目的基因mRNA 相對表達水平。目的基因相對表達量的ΔCt=實驗組或對照組目的基因Ctβ-actin Ct，ΔΔCt=實驗組ΔCt－對照組ΔCt。

1.8 統計學分析采用SPSS 23.0 統計軟件進行統計學分析。各組中細胞凋亡率，M1 型巨噬細胞陽性表達率，iNOS 和IL-1β mRNA 表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態表現體外培養24 h 后，對照組可見細胞呈圓形或橢圓形；M1 極化模型組可見細胞主要表現為梭形，并且有偽足伸出；與M1 極化模型組比較，GA 組可見梭形細胞減少，圓形細胞增多，且伸出偽足減少。見圖1。

圖1 各組細胞形態表現（×400）Fig.1 Morphology of cells in various groups（×400）

2.2 各組細胞凋亡率流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，對照組、M1 極化模型組和GA 組細胞凋亡率分別為（10.14±0.74）%、（10.29±0.62）%和（10.34±0.86）%，3 組間巨噬細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組巨噬細胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of macrophages in various groups

2.3 各組M1 型巨噬細胞陽性表達率對照組、M1 極化模型組和GA 組F4/80+iNOS+M1 型巨噬細胞陽性表達率分別 為（6.94±1.21）%、（89.2±1.38）%和（7.54±0.96）%，與對照組比較，M1 極化模型組F4/80+iNOS+M1 型巨噬細胞陽性表達率升高（P＜0.01），GA 組F4/80+iNOS+M1 型巨噬細胞陽性表達率升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與M1 極化模型組比較，GA 組F4/80+iNOS+M1 型巨噬細胞陽性表達率明顯降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組F4/80+iNOS+M1 型巨噬細胞表達情況Fig.3 Expressions of F4/80+iNOS+M1 macrophages in various groups

2.4 各組細胞中M1 型巨噬細胞相關因子mRNA表達水平與對照組比較，M1 極化模型組細胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01），GA 組細胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與M1 極化模型組比較，GA 組細胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表 達水平明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組細胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表達水平Tab.1 Expression levels of iNOS and IL-1β mRNA in cells in various groups (n=3，）

表1 各組細胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表達水平Tab.1 Expression levels of iNOS and IL-1β mRNA in cells in various groups (n=3，）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs M1 polarization model group.

3 討論

巨噬細胞作為機體重要的免疫細胞，具有很強的可塑性，在炎癥反應和維持機體穩態過程中發揮重要的作用。M1 型巨噬細胞主要通過分泌iNOS、TNF-α 和IL-1β 等，介導炎癥反應的發生［12-13］。LPS 誘導建立炎癥模型是建立炎癥模型的最常見方法，其機制為LPS 與細胞表面的CD14 結合，再結合TLR4 復合物，激活腫瘤壞死受體相關因子6，進一步激活轉化生長因子激活激酶1，使NF-κB 抑制性蛋白（NF-kappa B inhibitor，IκB）激酶磷酸化，導致IκB 降解，使NF-κB 信號通路激活，促進炎癥因子釋放，同時啟動iNOS 轉錄，釋放NO，促進巨噬細胞向M1 型極化［14-15］；IFN-γ 是體內NK細胞分泌的一種物質，其對巨噬細胞具有致敏作用，即該物質不會直接造成巨噬細胞的極化，或影響較小，但其會激發巨噬細胞的炎癥潛能，促進巨噬細胞對于LPS 等外界刺激的反應性增強，導致極化反應的增強［16-17］。小鼠腹腔巨噬細胞在醫學研究中應用十分普遍，是許多炎癥相關研究模型的常用細胞，也有文獻［9］報道采用RAW264.7 細胞系進行實驗，但有研究［18-19］顯示：RAW264.7 細胞系在連續培養的過程會不斷發生突變，長時間的多次傳代可能會導致細胞系的基因型和表型均發生變化，相比之下，原代細胞保持了細胞在體內的許多重要標志和功能，因此本實驗選用提取小鼠腹腔巨噬細胞誘導建立體外M1 型巨噬細胞極化模型。

GA 是多種新型藥用植物中較為常見的一種多酚類有機化合物，具有廣泛的臨床應用價值，可用于抑制腫瘤細胞形成，并誘導其凋亡，在腫瘤形成各階段中均起到預防和抑制作用［20-21］，在慢性骨關節炎中也可對軟骨關節起到一定的保護作用［22］，并可對防治神經退行性疾病具有潛在價值［23］。黃麗華等［9］研究顯示：GA 可通過抑制TLR4/NFκB 信號通路的表達而減少TNF-α、IL-6 和IL-1 等RAW264.7 巨噬細胞炎性因子的過度表達，從而有效保護LPS 所致的機體損傷。AHN 等［10］研究顯示：GA 能通過67LR 通路下調LPS 刺激的RAW264.7 巨噬細胞TLR4 信號轉導作用，抑制絲裂原活化蛋白激酶的激活，進而減少促炎細胞因子的生成。上述結果提示：GA 可通過多種信號通路調控巨噬細胞的功能。巨噬細胞具有可塑性，可在特定微環境作用下極化為M1 型巨噬細胞，后者可通過產生促炎反應因子iNOS、TNF-α、IL-6 和氧自由基等介導炎癥反應［24］。目前有關GA 對巨噬細胞的研究，多局限于GA 對巨噬細胞相關因子表達的影響，而有關GA 對巨噬細胞極化的研究尚未開展。本研究以小鼠腹腔巨噬細胞作為研究對象，建立M1 型巨噬細胞極化模型，觀察各組細胞中M1 型巨噬細胞占比及其相關炎性細胞因子mRNA表達水平。本研究結果顯示：在M1 型巨噬細胞極化過程中，巨噬細胞逐漸由圓形或橢圓形轉變為以梭形為主，并且有偽足伸出，而在經過GA 處理后，巨噬細胞的鏡下形態又發生了改變，梭形細胞和不規則細胞減少，圓形細胞增多且伸出偽足減少，表明GA 能夠影響M1 型巨噬細胞的極化過程。本研究中細胞凋亡率檢測結果顯示：M1 型巨噬細胞誘導分化體系在加入37.5 mg·L－1GA 后，其細胞凋亡率無明顯改變，說明GA 對巨噬細胞的凋亡無明顯影響。本研究中M1 型巨噬細胞的細胞表型和相關細胞因子mRNA 表達結果顯示：GA 能夠有效地減少F4/80+iNOS+M1 型巨噬細胞陽性表達率，下調IL-1β和iNOS mRNA 表達水平。F4/80＋是小鼠腹腔巨噬細胞的表面標志物［25］，而iNOS 和IL-1β 表達水平能夠反映M1 型巨噬細胞極化程度［26-27］，本研究結果表明：GA 能夠抑制IFN-γ/LPS 誘導的小鼠腹腔巨噬細胞向M1 型的極化。

研究［28-31］顯示：巨噬細胞可通過病原體相關分子模式借Toll 樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）或IL-1 信號激活IκB 激酶（IκB kinase，IKK）復合物，通過TLR2/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）關鍵炎癥信號通路調節巨噬細胞的M1 型活化。而GA 能通過競爭性拮抗作用阻止IκB 降解，進而抑制NF-κB 激活，阻斷TLR4/NF-κB 信號通路的表達［32-33］。本文作者推測GA 可能通過阻斷TLR4/NF-κB 信號通路表達而抑制M1 型巨噬細胞的極化，這一機制可能是GA 抑制M1 型巨噬細胞極化的原因。

綜上所述，37.5 mg·L－1GA 對巨噬細胞凋亡無明顯影響，但可抑制巨噬細胞向M1 型極化，提示其可用于M1 型巨噬細胞相關炎癥性疾病的治療。GA 作為一種多酚類有機抗炎藥物，可能通過多種機制影響M1 型巨噬細胞極化，其有關機制還有待于進一步的研究。