珍珠層粉復合富血小板纖維蛋白對顱骨缺損模型兔的修復作用

黃 瑩 ,馬福娟 ,MAGED ALI Al-Aroomi ,王觸靈 ,謝富強,

（1.蘭州大學第二醫院口腔科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學口腔醫學院，甘肅 蘭州 730000；3.武警甘肅總隊醫院口腔科，甘肅 蘭州 730000）

頜面部腫瘤、外傷和感染等是造成口腔頜面部缺損的常見原因。頜骨缺損后會影響患者的咀嚼、語言、吞咽和呼吸等功能，嚴重影響患者心理健康及生存質量。自體骨移植一直被認為是修復頜骨缺損的金標準，其優點為排斥反應小，價格便宜，自體移植失敗的主要原因是移植物壞死，通常是由血液供應不佳和繼發感染所引起［1］。同種異體骨、異種骨和合成骨移植也可用于頜骨缺損后的修復材料，但異體、異種移植物存在疾病傳播以及免疫排斥反應等問題［2］。近年來，生物工程材料被廣泛應用于頜骨缺損修復研究，不僅具有良好的生物相容性，且可以促進骨形成［3］。由軟體動物產生的珍珠層粉（nacre powder，NP）已成為一種具有潛力的骨替代品，其主要成分為碳酸鈣、1%～5%有機成分（可溶性和非可溶性）和微量元素等，是良好的成骨材料之一［4］；富血小板纖維蛋白（plateletrich fibrin，PRF）是自體來源的富血小板纖維蛋白，被稱為第2 代濃縮血小板，是由未添加任何生物制劑的自體外周血離心后產生的，相較第1 代濃縮血小板富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），PRF 制備簡單且排除了免疫排斥反應等問題，并且是一種密集的纖維蛋白網狀支架，由四分子結構的纖維基質蛋白聚合而成，含有生長因子、血小板和白細胞等成分［5］。PRF 富含血小板生長因子、生長轉化因子、表皮生長因子和血管內皮細胞生長因子等多種生長因子，可促進骨組織和軟組織創面再生，在口腔頜骨缺損修復、種植牙拔牙位點保存和軟硬組織增量、整形美容和創面修復等領域得到越來越廣泛的應用［6］。NP 不僅具有無機材料的機械性質，而且還含有可通過骨誘導促進成骨的有機基質，用作機械支撐和鈣儲存；PRF 具有三維網狀結構，不僅含有多種促進成骨的生長因子，且無免疫排斥反應，是移植過程中骨再生和骨修復的生長因子來源，在骨骼愈合過程中起著核心作用。本實驗探討了PRF 與NP 混合，發揮2 種材料各自不同的優點，以克服單一材料骨缺損修復的不足，闡明了對NP復合PRF材料成骨的效果，為今后該復合物用于頜骨缺損修復提供有力的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器12 只新西蘭兔均來自解放軍聯勤保障940 醫院動物實驗中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0029。NP（細度500 目，青島捷世康生物科技有限公司），骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）兔 多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），組織切片機（德國徠卡儀器有限公司），光學顯微鏡（浙江舜宇光學有限公司）、Micro CT系統（美國鉑金埃爾默股份有限公司）。

1.2 PRF 復合材料的制備兔耳中央動脈的末端區域脫毛消毒后，抽取5 mL 血液，2 700 r·min－1離心12 min，制備出PRF，無菌剪刀將PRF 凝塊剪碎。珍珠層粉用20 kGy Co60 輻照滅菌后備用，將消毒后的珍珠層粉與PRF 凝塊按2∶1 質量比例混合后置于直徑為8 mm、厚度為1 mm 的圓形模子中，成型后取出備用。

1.3 實驗動物模型的建立健康成年新西蘭大耳白兔，體質量為2.1～2.7 kg，共12 只。顱骨頂部矢狀縫周圍3 cm×3 cm 區域脫毛處理，耳緣靜脈推注3%戊巴比妥鈉（3 mL·kg－1），全身麻醉后，術區消毒，切開并剝離骨膜，于矢狀縫兩側造成4 個直徑為8 mm 的全層骨缺損，保留完整的硬腦膜。按顱骨缺損部位植入物不同分為4 組，分別等量植入各組成骨材料于缺損區：空白對照組、NP 組、PRF 組和復合組，每組3 只新西蘭兔。術后3 d 肌肉注射慶大霉素（8 萬U·kg－1）。分別于4、8 和12 周各處死4 只新西蘭兔。取出缺損顱骨待檢測。

1.4 大體觀察術后觀察各組新西蘭兔飲食情況及創口反應情況；肉眼觀察植入材料表面情況、缺損區骨痂量和骨的厚度。

1.5 Micro CT 掃描檢測各組新西蘭兔骨質狀況4%甲醛固定，采用高分辨率離體活體二合一Micro CT 儀器，Micro CT 掃描后三維重建，通過Analyze 12.0 分析軟件分離選擇的三維區域數據，分別測定骨礦物質密度（bone mineral density，BMD）以及新生骨體積/骨總體積百分數（bone

volume/ tissue volume，BV/TV）。

1.6 HE 染色觀察各組新西蘭兔顱骨組織病理形態表現切取新西蘭兔的顱骨，在10%甲醛溶液中固定并洗滌，EDTA 脫鈣，逐級乙醇脫水，浸蠟，包埋，進行HE 染色，觀察各組兔顱骨缺損部位骨組織病理形態表現。

1.7 免疫組織化學法檢測新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中BMP-2 和VEGF 蛋白表達水平免疫組織化學檢測各組兔顱骨缺損部位新骨組織中BMP-2 和VEGF 蛋白表達情況。一抗孵育VEGF（1∶200）和BMP-2（1∶200），滴加二抗和三抗孵育，沖洗，顯色。取同等倍數下的4 個不同視野進行拍照，Image Pro Plus 軟件測量蛋白表達的積分光密度值（integrated optical density，IOD）和面積，計算平均光密度值（optical density，OD），OD=IOD/面積，以OD 值代表目的蛋白表達水平。

1.8 統計學分析采用SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析。采用Graphpad Prism 6 軟件繪圖。各組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨的BMD 和BV/TV，BMP-2 和VEGF 蛋白表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功制備PRF抽取新西蘭兔血液離心后，血液共分3 層：上層為血漿層，中間層為PRF 凝塊層，下層為紅細胞層。取出中間層即為PRF（圖1）。

圖1 5 mL 血液離心后形成的PRFFig.1 PRF formed by centrifugation of 5 mL blood

2.2 大體觀察建立新西蘭兔顱骨缺損模型，并于4 個缺損部位按分組植入材料（圖2 和3）。術后新西蘭兔生命體征平穩，體質量逐漸增加，術區無腫脹，均存活至預定取材時間。大體觀察可見所有新西蘭兔顱骨缺損部位均有中央凹陷及邊緣成骨，但復合組新西蘭兔顱骨缺損部位較NP 組、PRF 組和空白對照組成骨明顯豐滿。

圖2 新西蘭兔顱骨缺損模型的制備Fig.2 Preparation of cranial defect model of New Zealand rabbit

圖3 各組新西蘭兔顱骨缺損區植入物Fig.3 Implants in cranial defect areas of New Zealand rabbits in various groups

2.3 Micro CT 掃描檢測新西蘭兔骨質情況CT三維重建結果顯示：4 周時復合組和NP 組新西蘭兔顱骨缺損區邊緣成骨較空白對照組和PRF 組明顯，但復合組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨面積更大；8 周時復合組新西蘭兔顱骨缺損部位邊緣及中央均有明顯新骨形成，但復合組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨面積更大；12 周時復合組新西蘭兔顱骨缺損部位形成新骨幾乎填滿缺損部位，而空白對照組、NP 組和PRF 組新西蘭兔顱骨均有明顯骨缺損影像（圖4）。Micro CT 掃描檢測結果顯示：復合組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨的BMD 和BV/TV均較空白對照組、NP 組和PRF 組明顯升高（P＜0.05），表明復合材料可明顯促進新骨的形成（表1 和2）。

表1 各組新西蘭兔骨礦物質密度Tab.1 BMD of rabbits in various groups (n=12，x±s，mg·cm－3）

圖4 Micro CT 掃描技術檢測新西蘭兔顱骨缺損部位新骨形成三維重建圖像Fig.4 Three dimension reconstruction photos of formation of new bone in cranial defect areas of New Zealand rabbits detected by of Micro CT scan

表2 各組新西蘭兔新生骨的BV/TVTab.2 BV/TV of rabbits in various groups（n=12，x±s，η/%）

2.4 各組新西蘭兔顱骨缺損區成骨情況4 周時，復合組新西蘭兔顱骨缺損部位內新生骨內有大量的骨細胞和類骨質形成，大量新生血管生成，成骨細胞增生活躍；8 周時，復合組新西蘭兔顱骨缺損部位成骨細胞增生，新生骨明顯礦化且排列稍紊亂，有初級骨小梁形成，新生血管增多，可見骨化中心；12 周時，復合組新西蘭兔顱骨缺損部位有骨礦化，形成更多骨小梁，骨質成熟，成熟的骨質中骨細胞排列有序，新生血管多，骨缺損邊緣多見成骨細胞，成骨細胞增生活躍（圖5）。

圖5 4、8 和12 周各組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織病理形態表現（HE，×20）Fig.5 Morphology of bone tissue of cranial defect areas of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks（HE,×20）

2.5 各組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中BMP-2 和VEGF 蛋白表達水平4、8 和12 周時復合組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中BMP-2 抗體（圖6）和VEGF 抗體（圖7）陽性棕色染色較空白對照組、NP 組和PRF 組明顯。4、8 和12 周時，與空白對照組比較，復合組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中BMP-2 和VEGF 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。見表3 和表4。

表3 4、8 和12 周時各組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中BMP-2 蛋白表達水平Tab.3 Expressions level of BMP-2 protein in new bone tissue in cranial defects of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (n=12，）

表3 4、8 和12 周時各組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中BMP-2 蛋白表達水平Tab.3 Expressions level of BMP-2 protein in new bone tissue in cranial defects of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (n=12，）

*P＜0.05 vs blank control group.

表4 4、8 和12 周時各組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中VEGF 蛋白表達水平Tab.4 Expressions level of VEGF protein in new bone tissue at cranial defects of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (n=12，）

表4 4、8 和12 周時各組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中VEGF 蛋白表達水平Tab.4 Expressions level of VEGF protein in new bone tissue at cranial defects of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (n=12，）

*P＜0.05 vs blank control group.

圖6 4、8 和12 周新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中BMP-2 蛋白表達情況(免疫組織化學，×40)Fig.6 Expressions of BMP-2 protein in new bone tissue in cranial defect areas of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (Immunohistochemistry,×40)

圖7 4、8 和12 周新西蘭兔顱骨缺損部位新骨組織中VEGF 蛋白表達情況(免疫組織化學，×40)Fig.7 Expressions of VEGF protein in new bone tissue in cranial defect areas of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (Immunohistochemistry,×40)

3 討論

頜骨缺損修復一直以來是困擾頜面外科醫生的難題，尋找一種有效的具有誘導成骨作用的骨替代材料是近年來很多學者研究的重點。本研究中NP的主要成分為碳酸鈣，為修復材料提供了成骨的主要成分，PRF 則提供了成血管的主要生長因子，兩者混合后成骨效果更明顯。本研究采用NP 和PRF 成功制備出具有成骨作用和骨誘導作用的骨替代物，并在動物實驗中驗證該復合材料較單純材料的成骨作用更加明顯，為頜骨缺損修復材料提供理論基礎及新思路。

顱骨缺損是目前公認最具有選擇性的骨誘導模型，兔顱骨缺損模型已被用來評估不同植骨材料和生長因子的骨再生潛力的模型［7］。該實驗模型適合于評估各種生物材料對骨再生的影響［7-8］，并且手術操作簡單，組織標本較易制取，因此兔顱骨缺損作為頜骨缺損的模型，可集中觀察復合材料骨誘導的情況，是本實驗的最佳動物模型。本實驗選擇新西蘭兔作為實驗動物是因其可以提供足夠的血液制作PRF，且兔骨骼發育與人類相似。兔顱骨缺損的尺寸為11 mm［9］，但考慮到減少個體間的差異、實驗的時長和研究目的等因素，故采用8 mm 的顱骨缺損。本研究中兔顱骨缺損模型的空白對照組于術后12 周時并未完全愈合，因此本實驗采用了8 mm 的兔顱骨缺損，并將愈合期設定為12 周，更符合生物學過程。

本實驗通過Micro CT 掃描、HE 染色以及免疫組織化學等方法來研究NP 復合PRF 復合材料的成骨能力。本研究中Micro CT 掃描三維重建結果顯示：復合組新西蘭兔顱骨缺損部位的成骨面積在8 周前新骨面積增長較緩慢，而到12 周時則新骨面積增長較快；12 周時NP 組與復合組新西蘭兔顱骨缺損部位新骨形成面積相當，兩者的BMD 和BV/TV 的比較差異有統計學意義，表明NP 組單獨植入時新骨的BMD 與復合組相差較小。前期研究［10］表明：NP 可促進成骨細胞分化并加速其礦化。本研究中復合組新西蘭兔在4～8 周BMD 和BV/TV增加較慢，而至12 周時，BMD 和BV/TV 增加較快，與以上研究結論一致，初步驗證了復合材料后期成骨能力較強。研究［11］顯示：PRF 能夠在骨移植愈合早期形成新骨。另外，NP 的降解性較差，后期成骨則主要依靠NP 可溶性有機基質（water soluble matrix，WSM）［11］。本研究中，第8 和12 周時，雖然NP 組成骨面積、BMD 增長較復合組稍低，但較PRF 組和空白對照組明顯升高，與復合組增長趨勢相當，可能與WSM 能夠增加BMD 有關［11］；NP 組和復合組較PRF 組和空白對照組成骨效果明顯，則表明NP 在復合組中成骨效果更加持久。因WSM 可明顯上調有絲分裂原活化蛋白激酶（MEK）/細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路，并且明顯提高成骨分化標志物蛋白表達水平，其中包括Ⅰ型膠原蛋白、runt相關轉錄因子2（RUNX2）、分泌磷蛋白1（SPP1）和堿性磷酸酶（ALP），故骨再生效果明顯［11］。而PRF 組的BMD 和BV/TV總體增長較慢，可能與PRF 釋放生長因子的高峰為7～14 d 有 關［12-13］。本研究 中HE 染色也支持Micro CT 掃描檢測結果，8～12 周復合組和PRF 組新西蘭兔新骨組織中成骨細胞活性明顯增加，表明NP 可激發成骨細胞活性。NP 刺激細胞活性是由于其中含有一種或多種信號分子可促進骨形成，WSM 蛋白可以直接通過刺激成骨細胞功能，間接誘導合成纖維基質蛋白（Ⅰ型膠原蛋白）來促進骨生成［14］。后期NP 的WSM 擴散增加，故骨再生后期成骨細胞增生活躍。

在骨修復再生過程中，VEGF 是一種有效的血管生成誘導物，參與血管形成的早期階段，誘導血管快速生長，形成的毛細血管為骨修復部位的細胞提供必要的營養來促進愈合過程，因此在骨再生和骨修復中VEGF 起著關鍵作用，可作為評價成骨效果的指標之一［15-17］。研究［18］顯示：在成骨細胞分化早期，VEGF 的表達水平較低，在成骨細胞分化的最終階段，VEGF 的表達水平明顯升高，在組織礦化過程中達到高峰。這與本實驗復合組新西蘭兔顱骨缺損區新骨組織中VEGF 表達趨勢一致，表明復合物在骨形成的整個過程中可持續刺激血管的生成。本研究結果顯示：在第4 周時，PRF 組的VEGF 的表達水平僅次于復合組，可能與PRF 可直接釋放VEGF 有關。本研究同樣也觀察到復合物可以促進BMP-2 的表達。BMPs 在成骨和骨再生塑形方面具有重要作用，參與細胞有絲分裂、趨化和細胞分化，且該蛋白具有骨誘導能力。BMPs 是屬于轉化生長因子（TGF）家族的一類多功能細胞因子家族，不僅是促進成骨細胞增殖、分化及礦化的有效調節因子，而且可使VEGF 的分泌增加［18］。其中，BMP-2 還可促進MSCs 向軟骨細胞和成骨細胞分化［19］。VEGF 和BMP-2 在骨再生修復中的功能是協調互補的，BMP-2 雖然不能直接誘導血管形成，但可以促進VEGF 表達的增加，繼而通過間接促進血管形成，以起到加速骨再生修復的作用；而VEGF 可促進軟骨細胞、成骨細胞和破骨細胞的增殖和分化，并通過上調BMP-2 的表達，從而促進MSCs 向軟骨細胞和成骨細胞的分化［19］。因此推測本研究中復合物修復新西蘭兔顱骨缺損可能誘導增加了VEGF 和BMP-2 的表達，促進血管生成，能夠較好地促進成骨細胞分化和礦化，從而增加顱骨缺損表面的血液供應和成骨能力，促進新骨的形成。

雖然NP 和骨骼礦物成分的有機基質與礦物的比例不同，但其均由具有微結構的復合礦化基質組成，體內和體外研究均提示其具有良好的骨誘導、骨傳導和生物相容性等特性［4］，可能是該復合物具有良好成骨作用的原因之一。前期研究［6］結果顯示：NP 在第4 周對人骨細胞（HBCs）的成骨促進作用較磷酸三鈣強。本研究中NP 組在第4 周，成骨效果較對照組和PRF 組明顯，但復合組成骨效果更明顯。

PRF 的成分與其特殊的結構有利于細胞黏附，并促進骨髓干細胞向成骨細胞分化［20］。軟硬組織修復與細胞的分裂、增殖、分化和凋亡有密切關聯，而上述過程可受到PRF 中相關生長因子的相互協作及有效的調控，促進膠原的合成、血管生成長入和誘導細胞分化，從而促進軟硬組織愈合［21］。目前研究均證明NP 和PRF 具備良好的骨誘導和骨傳導能力，并為本研究的結果提供支撐。

綜上所述，NP 復合PRF 復合材料，不僅能夠在早期釋放生長因子促進骨再生，還能夠在骨再生后期很好地刺激血管再生并促進骨組織的礦化，能夠加速骨再生。本課題組將在后續的實驗中，將NP 和PRF 復合制備成有孔材料更好地促進骨再生，同時檢測有孔復合材料的理化性質和生物學機制。