Notch1 信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞侵襲和順鉑耐藥的影響及其機(jī)制

陳立松 ,房 惠 ,王鶴霏 ,何程遠(yuǎn) ,蓋曉東 ,歷 春

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013；2.中南大學(xué)湘雅第三醫(yī)院婦科，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%～85%，其中肺腺癌占NSCLC 的40%～50%，其發(fā)病率逐年上升，且進(jìn)展快，預(yù)后差［1］。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和對(duì)化療藥物的耐藥作用是影響患者生存率的主要原因，也是肺腺癌治療的難點(diǎn)。Notch1 是Notch 信號(hào)通路中的關(guān)鍵受體，在調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和組織再生中均扮演重要角色［2］。研究［3-6］顯示：Notch1 信號(hào)通路在乳腺癌和卵巢癌等多種腫瘤組織中異常活化，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥有密切關(guān)聯(lián)。但Notch1 信號(hào)通路在肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制尚未完全闡明，其是否參與化療耐藥作用也尚不明確。因此，本研究通過(guò)γ-分泌酶抑制劑（DAPT）阻斷Notch1 信號(hào)通路，觀察肺腺癌細(xì)胞在侵襲、血管生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transitions，EMT）等方面的變化，以及其在順鉑耐藥中的作用，以期為抑制肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移和提高化療效果提供有效的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人肺腺癌細(xì)胞株A549 由北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone 公司），新生小牛血清（杭州四季青公司），Transwell 小室（美國(guó)Corning 公司），Matrigel 基質(zhì)膠（美國(guó)BD 公司），基質(zhì)金屬蛋白酶9（metalloproteinase-9，MMP-9）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、小鼠抗人Notch1 和GAPDH 抗體（武漢博士德生物技術(shù)有限公司），CCK-8 試劑盒、小鼠抗人波形蛋白（Vimentin）、兔抗人Hes1、N-鈣黏附蛋白（N-cadherin）、E 鈣黏附蛋白（E-cadherin）和MDR 相關(guān)蛋 白1（MDR-associated protein 1，MRP1）（碧云天生物技術(shù)有限公司），P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司），順鉑（江蘇豪森藥業(yè)有限公司）。Western blotting 電泳設(shè)備（美國(guó) Bio-Rad Laboratories 公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)A549 細(xì)胞用含有10%新生小牛血清和1%（V/V）青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 Transwell 小室法檢測(cè)各組A549 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)用Matrigel 膠包被Transwell 小室上室，以每孔6 × 104個(gè)細(xì)胞鋪于Transwell 小室上室，上室分別加入終濃度為0、10 和20 μmol·L－1的DAPT 無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液200 μL，下室加入含10%血清的DMEM 培養(yǎng)液600 μL，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。37 ℃共培養(yǎng)24 h，棉簽擦去上室細(xì)胞，PBS 緩沖液沖洗后蘇木素染色，顯微鏡下觀察并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞遷移能力。

1.4 ELISA 法檢測(cè)各組A549 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9 和VEGF 水平將A549 細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，次日于各組細(xì)胞內(nèi)分別加入終濃度為0、10 和20 μmol·L－1的DAPT 培養(yǎng)液。培養(yǎng)72 h 后，取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液各1 mL，具體步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。采用全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀檢測(cè)各孔在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，取平均A值，依標(biāo)準(zhǔn)品值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算MMP-9 和VEGF水平。

1.5 Western blotting 法檢測(cè)各組A549 細(xì)胞中Notch1、Hes1、Vimentin、N-cadherin 和E-cadherin蛋白表達(dá)水平將A549 細(xì)胞以每孔5 × 105個(gè)細(xì)胞鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，次日于各組細(xì)胞內(nèi)分別加入終濃度為0、10和20 μmol·L－1的DAPT 培養(yǎng)液。于48 h 收集各組細(xì)胞，RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，BCA 法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度，蛋白上樣量為30 μg，10% SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉后分別孵育抗Notch1（1∶300）、抗Hes1（1∶ 1 000）、抗E-cadherin（1∶1 000）、抗Vimentin（1∶1 000）和抗N-cadherin（1∶1 000）抗體4 ℃過(guò)夜。次日TBST 洗滌3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h。加入ECL 顯色底物，應(yīng)用成像系統(tǒng)進(jìn)行成像拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。利用Image J 軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.6 CCK-8 法檢測(cè)各組A549 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率將A549 細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，次日于各組細(xì)胞內(nèi)分別加入終濃度為0、10 和20 μmol·L－1的DAPT培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后各組細(xì)胞分別加入不同濃度的順鉑（0.625～5.000 mg·L－1）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后各組細(xì)胞分別加入CCK-8 試劑，每孔10 μL，2 h 后測(cè)定各孔在450 nm 波長(zhǎng)處的A 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均A值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組A值－給藥組A值）/對(duì)照組A值×100%。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)2 組A549 細(xì)胞中Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)水平將A549 細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，次日于各組細(xì)胞內(nèi)分別加入0 和1.25 mg·L－1順 鉑。于48 h 收集各組細(xì)胞，采 用“1.5”中的方法檢測(cè)和分析2 組A549 細(xì)胞中Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)水平。

1.8 Western blotting 法檢測(cè)各組A549 細(xì)胞中P-gp 和MRP1 蛋白表達(dá)水平將A549 細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，次日于各組細(xì)胞內(nèi)分別加入0 mg·L－1順鉑、1.25 mg·L－1順鉑、1.25 mg·L－1順鉑聯(lián)合10 μmol·L－1DAPT。于48 h 收集各組細(xì)胞，采用“1.5”中的方法檢測(cè)和分析各組A549 細(xì)胞中P-gp（1∶1 000）和MRP1（1∶1 000）蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組A549 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)、上清液中MMP-9 和VEGF 水平、細(xì)胞中各蛋白相對(duì)表達(dá)水平和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均符合正態(tài)分布且方差齊，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組A549 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組 ［（157.00±16.52）個(gè)］比 較，10 μmol·L－1DAPT 組侵襲細(xì)胞數(shù)［（102.00±12.53）個(gè)］和20 μmol·L－1DAPT 組［（85.00±9.54）個(gè)］侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組A549 細(xì)胞侵襲能力（蘇木素，×400）Fig.1 Invasion abilities of A549 cells in various groups detected by Transwell chamber assay (Hematoxylin,×400)

2.2 各組A549 細(xì)胞上清液中MMP-9 和VEGF 水平ELISA 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，10 和20 μmol·L－1DAPT 組MMP-9 和VEGF 水平均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞上清液中MMP-9 和VEGF 水平Tab.1 Levels of MMP-9 and VEGF in cell supernanant in various groups [n=3,,ρB/(μg·L－1)]

表1 各組細(xì)胞上清液中MMP-9 和VEGF 水平Tab.1 Levels of MMP-9 and VEGF in cell supernanant in various groups [n=3,,ρB/(μg·L－1)]

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

2.3 各組A549 細(xì)胞中Notch1、Hes1 和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，10 和20 μmol·L－1DAPT 組Notch1、Hes1、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2 和表2。

表2 各組A549 細(xì)胞中Notch1、Hes1 和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of Notch1,Hes1 and EMT-related proteins in A549 cells in various groups (n=3，)

表2 各組A549 細(xì)胞中Notch1、Hes1 和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of Notch1,Hes1 and EMT-related proteins in A549 cells in various groups (n=3，)

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

圖2 Western blotting 法檢測(cè)各組A549 細(xì)胞中Notch1、Hes1 和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of Notch1,Hes1 and EMT-related proteins in A549 cells in various groups detected by Western blotting method

2.4 各組A549 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與順鉑單獨(dú)作用組比較，10和20 μmol·L－1DAPT 聯(lián)合順鉑組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組A549 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率Tab.3 Inhibitory rates of growth of A549 cells in various groups（n=3,, η/%）

表3 各組A549 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率Tab.3 Inhibitory rates of growth of A549 cells in various groups（n=3,, η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with DDP group.

2.5 2 組A549 細(xì)胞中Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)水平1.250 mg·L－1順鉑作用A549 細(xì)胞48 h 后，Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)水平（0.77±0.08 和1.35±0.09）明顯高于0 mg·L－1順鉑組（0.53±0.06 和1.03±0.10），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.317，P＜0.05；t=3.986，P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 Western blotting 法檢測(cè)2 組A549 細(xì)胞中Notch1和Hes1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of Notch1 and Hes1 proteins in A549 cells in two groups detected by Western blotting method

2.6 各組A549 細(xì)胞中P-gp 和MRP1 蛋白表達(dá)水平與0 mg·L－1順鉑組比較，1.250 mg·L－1順鉑組P-gp和MRP1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與1.250 mg·L－1順鉑組比較，1.250 mg·L－1順鉑聯(lián)合10 μmol·L－1DAPT 組P-gp 和MRP1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖4 和表4。

表4 各組A549 細(xì)胞中P-gp 和MRP1 蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of P-gp and MRP1 proteins in A549 cells in various groups (n=3，)

表4 各組A549 細(xì)胞中P-gp 和MRP1 蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of P-gp and MRP1 proteins in A549 cells in various groups (n=3，)

*P＜0.01 compared with 0 mg·L－1 DDP group；△P＜0.01 compared with 1.250 mg·L－1 DDP group.

圖4 Western blotting 法檢測(cè)各組A549 細(xì)胞中P-gp和MRP1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of P-gp and MRP1 proteins in A549 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討論

近年來(lái)研究［7］顯示：異常的Notch1 信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，細(xì)胞內(nèi)Notch1 功能異常會(huì)導(dǎo)致未分化細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。30%的NSCLC 患者Notch1 信號(hào)通路異常活化［8］，其不僅參與NSCLC 細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，還導(dǎo)致NSCLC 患者的不良預(yù)后［9-11］。因此，闡明Notch1信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)對(duì)肺腺癌的診治具有重要意義。

腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移是多因素多步驟的過(guò)程。其中，腫瘤細(xì)胞穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellar matrix，ECM）是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟。因此，本研究采用Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)，在上室鋪基質(zhì)膠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，檢測(cè)DAPT 阻斷Notch1 信號(hào)通路后對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549 細(xì)胞侵襲能力的影響。本研究結(jié)果顯示：阻斷Notch1 信號(hào)通路可明顯降低肺腺癌細(xì)胞穿越基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)，表明Notch1 信號(hào)通路在肺腺癌細(xì)胞的侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果與HUANG 等［12］在肺癌中的研究結(jié)果相符，通過(guò)Transwell 小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Notch1 過(guò)表達(dá)的H1993 肺癌細(xì)胞系可明顯增加細(xì)胞遷移和侵襲的能力。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解ECM 最重要的酶類(lèi)，MMP-9 屬于Ⅳ型膠原酶，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮重要作用［13-14］。因此，本研究檢測(cè)阻斷Notch1信號(hào)通路后A549 細(xì)胞上清液中MMP-9 水平，結(jié)果顯示：MMP-9 水平隨DAPT 濃度的增加明顯降低，表明Notch1 信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)控MMP-9 的表達(dá)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的侵襲。BIN HAFEEZ 等［15］報(bào)道的前列腺癌細(xì)胞中Notch1 和MMP-9 的關(guān)聯(lián)支持本研究結(jié)果，前列腺癌細(xì)胞Notch1 敲除后MMP-9 的表達(dá)和活性呈濃度依賴(lài)性降低，提示Notch1 可能通過(guò)增強(qiáng)MMP-9 啟動(dòng)子活性直接調(diào)控其表達(dá)。

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移離不開(kāi)血管生成對(duì)其營(yíng)養(yǎng)支持。VEGF 是最重要的促血管生成因子之一，能增加血管的通透性，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，阻斷VEGF 通路可明顯抑制腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移［16］。ZANG 等［17］研究發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)Notch1 的胃癌細(xì)胞可明顯促進(jìn)VEGF 的分泌和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的增殖。本研究結(jié)果顯示：DAPT 處理A549 細(xì)胞后，VEGF 表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性下調(diào)，表明Notch1 信號(hào)通路可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成進(jìn)而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的侵襲。

EMT 是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的另一重要機(jī)制。在EMT 過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞。EMT 表型表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞標(biāo)記物，如E-cadherin，并獲得間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（Vimentin 和N-cadherin）的表達(dá)［18］。研究［19-21］表明：在乳腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤中Notch1 信號(hào)通路可介導(dǎo)EMT 發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示：DAPT 處理A549 細(xì)胞后，Notch1 及Notch1 通路下游重要分子靶點(diǎn)Hes1 的表達(dá)明顯下調(diào)，表明DAPT 處理可以阻斷Notch1 信號(hào)通路；進(jìn)一步研究顯示：阻斷Notch1 信號(hào)通路后EMT 的表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高及Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低均表現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性，上述結(jié)果表明Notch1 信號(hào)通路可能是誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT 過(guò)程的重要途徑之一。

順鉑是臨床治療卵巢癌和肺癌等惡性腫瘤常用的一線化療藥物，腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）影響其療效［22］。研究［23-24］顯示：Notch1 信號(hào)通路參與卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療抵抗作用，但其是否參與肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥作用尚不明確。本研究結(jié)果顯示：順鉑作用A549 細(xì)胞后，隨著DAPT 濃度的增加，細(xì)胞抑制率也明顯升高，表明阻斷Notch1 信號(hào)通路可增加順鉑的敏感性；順鉑作用A549 細(xì)胞后Notch1 和Hes1 的表達(dá)均明顯上調(diào)，表明肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥作用可能與Notch1 信號(hào)通路的異常活化密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR 與耐藥蛋白的表達(dá)有密切關(guān)聯(lián)，本研究結(jié)果顯示：順鉑作用A549 細(xì)胞后P-gp 和MRP1 表達(dá)水平明顯升高，而與DAPT 聯(lián)合作用可明顯抑制順鉑誘導(dǎo)的P-gp 和MRP1 表達(dá)上調(diào)，表明Notch1 信號(hào)通路可能是順鉑耐藥的重要途徑之一。

綜上所述，Notch1 信號(hào)通路可通過(guò)誘導(dǎo)MMP-9 和VEGF 蛋白表達(dá)及EMT 發(fā)生促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的侵襲，并可通過(guò)上調(diào)P-gp 和MRP1 表達(dá)參與肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥作用。本研究結(jié)果可為Notch1 信號(hào)通路成為阻斷肺腺癌侵襲和逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。