Rho/ROCK 信號通路在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征大鼠急性缺血性卒中發生中的作用

嵇 朋 ,郭向東 ,孫 根 ,寇啟星 ,屈雪萍 ,孫雅靜 ,江利敏

（1.河南省鄭州市第三人民醫院 河南大學腫瘤醫院神經內科，河南 鄭州 450000；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻喉科，河南 鄭州 450000；3.河南中醫藥大學第一附屬醫院體檢中心，河南 鄭州 450000）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）為潛在致死性的睡眠呼吸疾病，是各種原因導致的上氣道狹窄和阻塞，出現睡眠狀態下的呼吸暫停和低通氣，引起低氧血癥、高碳酸血癥和睡眠結構紊亂，并造成心腦血管并發癥及多臟器損害［1-2］。急性缺血性卒中是OSAHS 常見的并發癥，研究［3］顯示：OSAHS 患者發生急性缺血性卒中病變的相對危險度（odd ratio，OR）為3.75（95%CI：1.52～7.59），發生率是非OSAHS 患者的10.3 倍，對患者生命健康和生活質量造成了極大影響。因此，了解OSAHS 患者發生急性缺血性卒中病變的機制，對于OSAHS 急性缺血性卒中病變的預防和治療具有重要意義。Ras 同源基因（Ras homolog gene，Rho）/Rho 相關卷曲螺旋形成蛋白激 酶（Rho associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK）信號通路參與細胞的骨架結構改變、增殖、分化、黏附和收縮等多種生物活動，與動脈粥樣硬化和缺血/再灌注損傷等腦血管疾病的發生有密切關聯［4-5］。目前有關Rho/ROCK 信號通路在缺血性心腦血管疾病中作用的研究較多，而該通路在OSAHS 急性缺血性卒中發生發展中作用的機制研究尚少。故本研究通過建立OSAHS 急性缺血性卒中大鼠模型，探討Rho/ROCK 信號通路在OSAHS 急性缺血性卒中的作用，以期為OSAHS后急性缺血性卒中病變的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器50 只SPF 級雄性SD 大鼠，6 周齡，體質量為200～220 g，購自天津中檢科健檢驗檢測有限責任公司，動物生產許可證號：SCXK（津）2018-0002。間歇低氧艙（淮北正華信息科技有限公司），UltraMaxO2氧濃度測試儀（深圳市齊放實驗檢測技術有限公司，靈敏度：0∶1），壓縮氮氣（濃度＞99.99%，唐山大眾氣體高科技有限公司），Rho 抑制劑C3 轉移酶蛋白（美國Cytoskeleton 公司），RNA 提取試劑盒（美國Fermentas 公司），逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司），BCA 蛋白定量分析試劑盒（美國Thermo 公司），兔抗鼠Rho 單抗、ROCK 單抗、肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）及磷酸化MLC（phosphorylated-MLC，p-MLC）多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。SM2010R 切片機（德國徠卡顯微系統貿易公司），ABI ViiA TM7 實時熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）儀（美 國Life Technologies 公 司），Synergy-HD 顯微鏡（日本東芝公司），DYCZ-22A電泳儀（上海向帆儀器有限公司），CheniDoc XRS化學發光成像分析系統（美國Bio-Rad 公司），RM6240 型多道生理信號采集處理系統（成都貝斯達儀器有限公司），Morris 水迷宮（廣州飛迪生物科技有限公司）。

1.2 大鼠OSAHS 模型和急性腦卒中模型的制備參照文獻［6］建立OSAHS 模型：大鼠放入間歇低氧艙，關閉艙門后，艙內循環沖入氮氣、氧氣和壓縮空氣，每循環120 s（氮氣30 s，靜息10 s，氧氣20 s，壓縮空氣60 s）。測氧儀檢測艙中氧濃度，調節氣流量，確保每循環艙內最低氧濃度為4%～6%，后逐漸恢復至21%，每天8 h，基于大鼠夜間活動白天睡眠特性，進倉時間為每天9：00～17：00，其余時間常規室內飼養，持續8 周。參照文獻［7］采用改良Longa 線栓法制備大鼠急性腦卒中模型：術前禁食8 h，10%水合氯醛（0.35 mg·kg－1）麻醉后仰臥固定于手術臺。頸部備皮，沿正中線切開右側頸部皮膚，鈍性分離肌肉和迷走神經，暴露頸總動脈及頸外動脈，結扎頸外動脈和頸總動脈近心端，在頸總動脈分叉處備線。于頸總動脈分叉處以動脈夾暫時夾閉，在結扎上方剪口，插入線栓，輕輕結扎備線固定線栓于血管內，后開放動脈夾，將線栓推入頸動脈內頭端至大腦中動脈起始處，扎緊備線，縫合。術后6 h 行Longa 評 分［8］，按照李克特6 級量表評分：0 分為無神經功能損傷，1 分為不能完全伸展左前爪，2 分為行走時向左側旋轉，3 分為行走時向左側傾斜，4 分為不能自發行走且意識喪失，5 分為死亡，1～3 分為模型制備成功。

1.3 實驗動物分組50 只SD 大鼠適應性飼養1周，稱體質量后隨機分為假手術組、OSAHS組、卒中組、OSAHS 后卒中組和Rho 抑制劑組，每組10 只。分組后OSAHS 組大鼠采用慢性間歇性低氧法建立OSAHS 模型；卒中組大鼠采用線栓法阻斷大鼠大腦中動脈建立急性缺血性卒中模型；OSAHS 后卒中組和Rho 抑制劑組大鼠在OSAHS模型制備成功后2 h 以線栓法阻斷大鼠大腦中動脈建立OSAHS 后卒中模型；假手術組常規吸入空氣，不阻斷大腦中動脈（線栓插入頸總動脈約0.5 cm，其步驟相同）。Rho 抑制劑組大鼠在OSAHS 造模期間至卒中模型制備前給予C3 轉移酶5 μg·kg－1·d－1腹腔注射。OSAHS 后卒中組死亡2 只大鼠，卒中組和Rho 抑制劑組各死亡1 只大鼠，假手術組死亡1 只大鼠，剔除死亡鼠。

1.4 各組大鼠一般情況觀察、呼吸頻率和神經功能檢測觀察大鼠一般情況，包括精神狀態、飲食飲水、呼吸時腹部節律變化、口鼻及耳緣皮膚色澤和活動等。建模后24 h，采用生理記錄儀記錄大鼠的呼吸頻率，根據Longa 評分評價神經功能損害。Morris 水迷宮實驗評價空間學習記憶能力：Morris水迷宮根據方位劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4 個象限，于任意象限中心水面下2 cm 處放置一平臺，距池壁20 cm，水溫保持（24±2）℃，水面覆蓋黑色塑料泡沫隱蔽平臺，水池周圍貼有三角形或圓形等幾何圖像作為參照線索，實驗過程中水池及周圍環境不變。大鼠依次面向池壁從4 個象限入水點放入水中，記錄大鼠爬上平臺時間，即逃避潛伏期，若超過60 s 未成功尋找平臺，則引導其爬上平臺，并在平臺停留20 s，逃避潛伏期為60 s，每一象限實驗間隔時間為20 min，每天4 個象限入水點各訓練1 次，隱蔽平臺實驗連續5 d，記錄第5 天逃避潛伏期。于第6 天撤去平臺，從任意象限將大鼠面向池壁放入水中，記錄其60 s 內穿越平臺次數。

1.5 TTC 染色測定各組大鼠腦梗死體積神經功能損害評價后脫頸處死大鼠，各組選取4 只大鼠取出完整腦組織，迅速放置于－20 ℃冰箱中冷凍30 min，取冠狀面制作2 mm 厚度腦片5 片，后迅速放置于37 ℃、2% TTC 溶液中染色30 min，取出置于10%中性緩沖甲醛溶液固定24 h 后攝像，紅色區域為正常腦組織，蒼白色區域為腦卒中區，以Image-pro plus 6.0 圖像分析軟件計算大鼠腦梗死體積，以黑色實驗臺為背景將腦片整齊擺放于桌面，吸干表面水分后拍照，將獲得圖片以Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量梗死灶面積，以面積之和乘以厚度（2 mm）獲得腦梗死體積近似值，以腦梗死體積/全腦體積作為統計參數。

1.6 HE 染色法觀察各組大鼠腦皮質區病理表現每組剩余4 只大鼠處死后快速取出右側軟腦膜下方皮質組織，以10%中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成5 μm 厚度冠狀切片，進行HE 染色，顯微鏡下觀察腦皮質層組織病理形態表現；剩余皮質組織保存于－80 ℃冰箱中備用。

1.7 RT-qPCR 法檢測各組大鼠腦組織中Rho、ROCK 和MLC mRNA 表達水平取冷凍保存皮質組織50 mg，Trizol 法提取總RNA，逆轉錄得到cDNA，產物以1%瓊脂凝膠電泳鑒定RNA 完整性，RT-qPCR 法鑒定目的基因表達水平。嚴格按照試劑盒說明書設定反應體系，反應條件：94 ℃預變性1 min；94 ℃變 性20 s，60 ℃退 火25 s，72 ℃延伸30 s，重復35 個循環。以β-actin 為管家基因，采用2－△△CT法計算目的基因的mRNA 表達水平，實驗連續重復3 次，取3 次結果平均值。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.8 Western blotting 法檢測各組大鼠腦組織中Rho、ROCK、MLC 和p-MLC 蛋白表達水平取冷凍保存皮質組織50 mg，BCA 法測定各組大鼠腦組織蛋白濃度，取10 μg 待檢測樣本與上樣緩沖液混合，100 ℃水浴8 min，12 000 r·min－1離心30 min，離心半徑12 cm，取上層清液，10% SDS-PAGE 分離，電轉儀電轉40 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，化學發光顯影，定影，以目的蛋白條帶與內參β-actin 蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白表達水平。

1.9 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠呼吸頻率，神經功能損傷評分，逃避潛伏期，穿越平臺次數，腦梗死體積，腦組織中Rho、ROCK、MLC mRNA 和蛋白表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般情況假手術組大鼠食欲正常，精神狀態良好，活動正常，無其他異常表現；OSAHS 組大鼠食欲下降，精神不佳，活動減少，且有呼吸急促、吸氣時間延長、口鼻和耳緣青紫和呼吸時胸腹起伏較大等缺氧表現；卒中組大鼠食欲下降，精神萎靡，活動量減少，并伴有左側肌張力增高、抬頭困難、豎毛、向左側旋轉追尾等神經功能損傷表現；OSAHS 后卒中組大鼠建模后食欲下降、精神不佳、活動減少，缺氧、神經功能損傷癥狀較其他組更為嚴重；Rho 抑制劑組大鼠精神狀態與OSAHS 組相當。

2.2 各組大鼠呼吸頻率和神經功能損傷評分與假手術組比較，OSAHS 組大鼠呼吸頻率增加（P＜0.05）；與OSAHS 組比較，卒中組大鼠呼吸頻率降低（P＜0.05）；與卒中組比較，OSAHS 后卒中組大鼠呼吸頻率和Longa 評分增加（P＜0.05），Rho 抑制劑組大鼠Longa 評分降低（P＜0.05）；與OSAHS 后卒中組比較，Rho 抑制劑組大鼠呼吸頻率與Longa 評分均降低（P＜0.05）；假手術組與卒中組、OSAHS 組與OSAHS 后卒中組大鼠的呼吸頻率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠呼吸頻率和神經功能損傷評分Tab.2 Respiratory frequenciesandneurological impairment scores of rats in various groups（）

表2 各組大鼠呼吸頻率和神經功能損傷評分Tab.2 Respiratory frequenciesandneurological impairment scores of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with OSAHS group；#P＜0.05 compared with stroke group；○P＜0.05 compared with post-OSAHS stroke group.“－”：No data.

2.3 Morris 水迷宮實驗中各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數與假手術組比較，OSAHS 組大鼠逃避潛伏期延長（P＜0.05），穿越平臺次數減少（P＜0.05）；與OSAHS 組比較，卒中組大鼠逃避潛伏期延長（P＜0.05），穿越平臺次數減少（P＜0.05），OSAHS 組與Rho 抑制劑組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與卒中組比較，OSAHS 后卒中組大鼠的逃避潛伏期延長（P＜0.05），穿越平臺次數減少（P＜0.05）；與OSAHS 后卒中組比較，Rho 抑制劑組大鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿越平臺次數增多（P＜0.05）。見表3。

表3 Morris 水迷宮實驗中各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數Tab.3 Escape latencies and times of crossing platform in Morris water maze test of rats in various groups（）

表3 Morris 水迷宮實驗中各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數Tab.3 Escape latencies and times of crossing platform in Morris water maze test of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P ＜0.05 compared with OSAHS group；#P＜0.05 compared with stroke group；○P＜0.05 compared with post-OSAHS stroke group.

2.4 各組大鼠腦梗死體積卒中組、OSAHS 后卒中組和Rho 抑制劑組大鼠腦梗死體積分別為（102.33±10.50）mm3、（155.50±12.45）mm3和（88.45±7.85）mm3。與卒中組比較，OSAHS 后卒中組大鼠腦梗死體積增大（P=0.005）；與OSAHS 后卒中組比較，Rho 抑制劑組梗死體積縮小（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色結果Fig.1 TTC staining results of brain tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠腦皮質區組織病理形態表現HE 染色結果顯示：假手術組大鼠皮質層組織結構正常，無缺血性改變，神經元形態完整，其余組均有不同程度病理學改變。OSAHS 組大鼠有皮層組織結構疏松改變，少量神經元變性；卒中組和OSAHS 后卒中組大鼠皮層組織結構紊亂明顯，可見壞死軟化病灶，有液化性壞死表現，大量神經元變性壞死，其中OSAHS 后卒中組大鼠腦皮質區病理變化更為嚴重；Rho 抑制劑組大鼠腦皮質區組織病理變化與OSAHS 組相近。見圖2。

圖2 各組大鼠腦皮質區組織病理形態表現（HE，×400）Fig.2 Pathomorphology of cerebral cortex tissue of rats in various groups（HE，×400）

2.6 各組大鼠腦組織中Rho、ROCK 和MLC mRNA 表達水平各組大鼠腦組織中MLC mRNA表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與假手術組比較，OSAHS 組大鼠腦組織中Rho 和ROCK mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與OSAHS 組比較，卒中組大鼠腦組織中Rho 和ROCK mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與卒中組比較，OSAHS 后卒中組大鼠腦組織中Rho 和ROCK mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與OSAHS 后卒中組比較，Rho 抑制劑組大鼠腦組織中Rho 和ROCK mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠腦組織中Rho、ROCK 和MLC mRNA 表達水平Tab.4 Expression levels of Rho,ROCK and MLC mRNA in brain tissue of rats in various groups （n=4,）

表4 各組大鼠腦組織中Rho、ROCK 和MLC mRNA 表達水平Tab.4 Expression levels of Rho,ROCK and MLC mRNA in brain tissue of rats in various groups （n=4,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with OSAHS group；#P＜0.05 compared with stroke group；○P＜0.05 compared with post-OSAHS stroke group.

2.7 各組大鼠腦組織中Rho 和ROCK 蛋白表達水平及p-MLC/MLC比值與假手術組比較，OSAHS組大鼠腦組織中Rho 和ROCK 蛋白表達水平及p-MLC/MLC 比值升高（P＜0.05）；與OSAHS 組比較，卒中組大鼠腦組織中Rho 和ROCK 蛋白表達水平及p-MLC/MLC 比值升高（P＜0.05）；與卒中組比較，OSAHS 后卒中組的Rho 和ROCK 蛋白表達水平及p-MLC/MLC 比值升高（P＜0.05）；與OSAHS 后卒中組比較，Rho 抑制劑組Rho 和ROCK 蛋白表達水平及p-MLC/MLC 比值降低（P＜0.05）。見圖3 和表5。

表5 各組大鼠腦組織中Rho 和ROCK 蛋白表達水平及p-MLC/MLC 比值Tab.5 Expression levels of Rho and ROCK proteins and ratios of P-MLC/ MLC in brain tissue of rats in various groups （n=4,）

表5 各組大鼠腦組織中Rho 和ROCK 蛋白表達水平及p-MLC/MLC 比值Tab.5 Expression levels of Rho and ROCK proteins and ratios of P-MLC/ MLC in brain tissue of rats in various groups （n=4,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with OSAHS group；#P＜0.05 compared with stroke group；○P＜0.05 compared with post-OSAHS stroke group.

圖3 各組大鼠腦組織中Rho、ROCK、p-MLC 和MLC 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of Rho,ROCK,p-MLC and MLC proteins in brain tissue of rats in various groups

3 討論

研究［9］表明：OSAHS 引起的低氧血癥、高碳酸血癥及反復夜間覺醒可造成血流動力學的改變，激活交感神經，引起凝血系統異常和血管損傷，是導致缺血性卒中病變的獨立危險因素。故需進一步明確OSAHS 與急性缺血性卒中病變的機制，以提高臨床認知，有效控制OSAHS 后急性缺血性卒中病變的發生發展。

本研究中建模后除假手術組外其他各組大鼠均有不同程度活動減少表現，OSAHS 后卒中組大鼠缺氧及神經損傷表現最為嚴重，且呼吸頻率增加，逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少，腦梗死體積較大，腦皮質層有明顯的組織結構紊亂，神經元變性壞死，OSAHS 后卒中組大鼠上述表現與變化較OSAHS 組與卒中組嚴重，說明OSAHS 可引起神經細胞損傷，影響大鼠空間和學習記憶能力，加重OSAHS 后急性缺血性卒中的神經功能損傷。OSAHS 引起的夜間間歇性低氧使機體出現缺氧-復氧-再灌注的循環過程，在缺氧時，一氧化氮（nitric oxide，NO）合成降低，引起氧化應激和炎癥因子的釋放，造成內皮損傷，復氧-再灌注過程產生了大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），使細胞發生氧化損傷，對機體代謝旺盛、需氧量大的腦及心臟等器官造成損傷［10-11］。岑瑞祥等［12］研究表明：慢性間歇性缺氧可造成機體壓力感受性反射和心臟活動的控制下降，引起腦干和神經元損傷。郭向飛等［13］證實：OSAHS 模式低氧能加重腦缺血/再灌注大鼠學習記憶功能障礙，引起大鼠海馬區神經細胞丟失和神經元超微結構損傷。以上研究均表明：OSAHS 能引起腦組織和神經功能受損，加重OSAHS 后腦卒中的神經功能損傷。

Rho/ROCK 信號通路廣泛存在于機體各組織中，參與細胞的收縮、黏附、遷移、增殖和細胞骨架的形成等多種生物學活動，影響心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤和神經損傷性疾病等多種疾病的發生發展［14］。Rho 是小分子鳥嘌呤核苷酸結合蛋白，能促進應力纖維形成和伸長、肌動蛋白束收縮和定向粘連，調節神經元膜表面到肌動蛋白骨架信號的傳導［15］。ROCK 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是Rho 下游靶效應分子，可接受Rho 傳遞的活化信號，介導其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應，調節肌動低蛋白-肌球蛋白細胞骨架組織［16］。MLC 是Rho/ROCK 的下游信號分子，可被活化的ROCK磷酸化激活，從而激活肌球蛋白頭部ATP 酶，誘導細胞收縮，導致細胞骨架改變［17］。研究［18-19］表明：Rho/ROCK 信號通路可誘導單核-巨噬細胞的趨化與遷移，誘導血漿中脂質物質的沉積，促進動脈粥樣硬化和血栓的形成。肖衛東等［20］研究發現：Rho/ROCK 信號通路參與缺血性腦血管疾病的血流動力學障礙及炎癥反應的發生，并能直接作用于神經元，導致生長錐塌陷及神經突起回縮。上述研究均證實：Rho/ROCK 信號通路在動脈粥樣硬化和缺血性腦血管疾病等的發生中起重要作用。本研究結果顯示：與假手術組比較，OSAHS 組、卒中組和OSAHS 后卒中組大鼠腦組織中Rho、ROCK mRNA 及蛋白表達水平和p-MLC/MLC 比值均增加，而經Rho 抑制劑干預后，Rho 和ROCK mRNA 和蛋白表達水平，p-MLC/MLC 比值均降低，且Rho 抑制劑組大鼠的精神活動、神經功能癥狀表現和腦梗死體積等相關指標均較OSAHS 后卒中組減輕，提示Rho/ROCK 信號通路的激活參與OSAHS 急性缺血性卒中病變的發生機制。本研究中各組大鼠腦組織中MLC mRNA 表達水平比較差異無統計學意義，其原因可能為MLC mRNA 翻譯成蛋白后通過蛋白的磷酸化發揮作用。

綜上所述，OSAHS 大鼠急性缺血性卒中病變的發生機制可能與Rho/ROCK 信號通路的激活有關，可考慮將Rho/ROCK 信號通路作為心血管疾病的治療靶點。Rho 和ROCK 在體內的分布廣泛，涉及的生理功能復雜，與其他信號通路的相互作用尚未明確，在今后的研究中仍需進一步深入探索Rho/ROCK 信號通路的生理功能在OSAHS 及急性缺血性卒中病變的作用，為此類疾病的診療提供幫助。