人臍帶間充質(zhì)干細胞對宮頸癌HeLa 細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制

王 琛,田 君,程海玲

（河南大學(xué)淮河醫(yī)院婦科,河南 開封 475000）

人臍帶間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是源自中胚層的一種多潛能干細胞，具有體外易擴增、取材方便和容易導(dǎo)入外源基因等優(yōu)點，因而被作為天然的基因和細胞治療的種子來源，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中均具有重要價值［1-2］。MSCs 本身有遷移特點，可向腫瘤組織趨化和遷移，是腫瘤靶向治療理想載體，因而分析MSCs 對于腫瘤細胞生物學(xué)特征的影響十分必要［3］。宮頸癌作為婦科最常見的惡性腫瘤，其病死率位居婦科腫瘤的前列，且目前尚無特效療法。有學(xué)者主張發(fā)揮MSCs 亞全能分化潛能，通過旁分泌機制，調(diào)控宮頸癌細胞生物學(xué)活性，為宮頸癌基因治療開辟新道路［4-5］。然而，目前關(guān)于MSCs 對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響及內(nèi)在機制的報道較少。本實驗通過集落形成實驗和凋亡分子蛋白檢測等方法，分析MSCs 對宮頸癌HeLa 細胞增殖凋亡能力的影響，并探討其相關(guān)機制，為MSCs 治療宮頸癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人HeLa 細胞為本實驗室保存。胎牛血清（fetal FBS）、DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶-EDTA 溶液（北京百奧萊博科技有限公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），細胞增殖及毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司），Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（apoptosis Detection Kit）和碘化丙啶（propidine iodide，PI）（南京碧波生物科技有限公司），兔抗人B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、半胱天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate-specific proteinase-3，Caspase-3）和P53 單克隆抗體（一抗）以及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG（二抗）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），增強化學(xué)發(fā)光法（electrochemiluminescence，ECL）顯色 試劑盒和Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。Nunc EasYFlask 細胞培養(yǎng)瓶和細胞培養(yǎng)板（北京隆福佳生物科技有限公司），DxFLEX流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.2 人臍帶MSCs 分離和培養(yǎng)經(jīng)家屬知情同意后，采集足月新生兒臍帶，并在6 h 內(nèi)進入制備程序。無菌條件下剪碎臍帶，體積控制在1 mm×1 mm×1 mm，以貼壁法培養(yǎng)臍帶，即接種于內(nèi)含專用培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，2～4 d 換液1 次，待有成纖維樣細胞爬出后1～2 周，可去除組織塊，獲得MSCs細胞。取MSCs 細胞加入內(nèi)含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃、95%飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h 后半量換液3 次，每隔2 d 換1 次，隨后每隔3～5 d 換1 次。待原代培養(yǎng)細胞鋪滿瓶底，收集條件培養(yǎng)液分裝，－80 ℃下保存、備用，應(yīng)用0.25%的胰蛋白酶對細胞進行常規(guī)消化、傳代，F(xiàn)4 代后細胞用于后續(xù)實驗。倒置顯微鏡觀察其細胞形態(tài)，在F5 代時，40 倍光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。待細胞融合度為80%～90%時，采用Triple 液消化，絕大部分細胞消化完全后，吸管吹打，轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃、1 000 r·min－1離心5 min，離心半徑為10 cm，傾倒液體，采用流式細胞儀檢測離心MSCs 細胞表面抗原標志物CD90、CD105、CD34 和CD45，即將收集的細胞與一抗CD90、CD105、CD34 和CD45 常溫孵育0.5 h，與cy3-二抗孵育0.5 h，以未加一抗僅加二抗的MSCs 為平行對照組。

1.3 宮頸癌HeLa 細胞培養(yǎng)應(yīng)用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)宮頸癌HeLa 細胞，3 d 傳代一次。

1.4 細胞集落形成實驗檢測細胞集落形成抑制率取對數(shù)生長期宮頸癌HeLa 細胞，采用胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，在6 cm 平板上接種1 000 個細胞，細胞貼壁后，加入20%和60%的MSCs 條件培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)8 d，顯微鏡下觀察細胞集落形成情況。每組細胞設(shè)置5 個復(fù)孔，取出平板后以甲醇固定20 min，以PBS 緩沖液沖洗1 次，吉姆薩染色15 min。拍照，統(tǒng)計20%和60% MSCs 對宮頸癌HeLa 細胞集落形成抑制率。

1.5 細胞增殖實驗檢測細胞增殖抑制率收集對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa 細胞，濃度為2×105mL－1，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔50 μL，次日將不同濃度的第5 代MSCs（5%、10%、20%、40%和60%）加入絲裂霉素C 處理3 h，待細胞貼壁后，以DMEM 培養(yǎng)基洗滌3 次，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)置5 個復(fù)孔，以RPMI 1640 完全培養(yǎng)液作為空白對照。將處理后的MSCs 細胞調(diào)節(jié)為適當(dāng)濃度，與HeLa 細胞共同培養(yǎng)接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每組5 個復(fù)孔，將96 孔細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。24 h 后取出96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8 液，在37 ℃條件下孵育2 h，采用酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔吸光度（A）值。依據(jù)實驗結(jié)果，計算細胞增殖抑制率。實驗分組：①對照組，僅加入宮頸癌HeLa 細胞；②MSCs 組，加入MSCs 細胞；③實驗組，根據(jù)HeLa 細胞和MSCs 細胞比例（依次為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1 和8∶1）不同分組。MSCs 對HeLa 細胞的增殖抑制率的計算公式：細胞增殖抑制率=［1－（實驗組A 值－MSCs 組A 值）/對照組A 值］×100%。

1.6 細胞凋亡實驗檢測細胞凋亡率收集MSCs處理48 h 后的宮頸癌HeLa 細胞（HeLa 細胞和MSCs 細胞比例為1∶3）作為實驗組，以單純宮頸癌HeLa 細胞作為對照組，使用預(yù)冷后的PBS 緩沖液洗滌3 次，取適量結(jié)合PBS 緩沖液重懸細胞，將細胞密度調(diào)節(jié)為1×106mL－1，取100 μL 細胞懸液置入流式管內(nèi)，加入5 μ L Annexin Ⅴ/FITC 和10 μL 的PI，混合后搖勻，室溫避光孵育15 min，以300 目尼龍網(wǎng)過濾，采用流式細胞儀測定細胞凋亡率。細胞凋亡率=細胞凋亡數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測宮頸癌HeLa 細胞中凋亡分子蛋白表達水平MSCs 處理HeLa 細胞0、24 和48 h 后，收集細胞，以1×PBS 緩沖液洗滌2 次，采用RIPA 蛋白裂解液提取細胞總蛋白，4 ℃、1 000 r·min－1離心15 min，離心半徑為8 cm，取上清液。應(yīng)用Bradford 法檢測蛋白含量，蛋白提取物定量后，各組取等量蛋白，加入上樣緩沖液，置入沸水中變性，以50 μg 待檢測蛋白質(zhì)樣品，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，采用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（兔抗人caspase-3、P53 和Bcl-2，濃度為1∶1 000），4 ℃過夜，采用TBST 漂洗，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG（濃度為1∶8 000），常溫孵育1 h，經(jīng)TBST 漂洗3 次，以ECL 試劑盒顯色，在LAS-4000 凝膠成像儀上顯影，分析各個條帶灰度值。目的蛋白表達水平=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細胞凋亡率及蛋白相對表達水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MSCs 形態(tài)表現(xiàn)光學(xué)顯微鏡下觀察可見：臍帶分離細胞接種72 h 后有少量細胞貼壁，1 周后逐漸變成扁平單層細胞，呈簇狀、旋渦狀生長，伴隨細胞密度增加，細胞體隨之變細長，形態(tài)與成纖維細胞類似。見圖1。

圖1 從臍帶中分離出的MSCs 形態(tài)表現(xiàn)（×40）Fig.1 Morphology of MSCs isolated from umbilical cord (×40)

2.2 MSCs 細胞表面抗原分析利用流式細胞術(shù)檢驗MSCs 細胞表面抗原標記物CD90、CD34、CD45 和CD105，結(jié)果顯示：MSCs 細胞CD90 和CD105 呈陽性表達，CD34 和CD45 呈陰性表達，符合干細胞表型。見圖2。

圖2 MSCs 表面抗原標志物的表達Fig.2 Expressions of surface antigen markers of MSCs

2.3 各組HeLa 細胞集落形成抑制率將宮頸癌HeLa 細胞與20%和60%濃度的MSCs 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)共8 d，進行集落形成實驗，結(jié)果顯示：加入20%和60%的MSCs 條件培養(yǎng)基時，宮頸癌HeLa細胞集落形成抑制率分別為18.56% 和37.64%。見圖3。

圖3 MSCs 條件培養(yǎng)基作用下各組HeLa 細胞集落形成能力Fig.3 Colony forming abilities of HeLa cells in various groups after treated with MSCs conditioned medium

2.4 各組HeLa 細胞增殖抑制率隨著HeLa 細胞/MSCs 細胞比例增加，MSCs 細胞對HeLa 細胞增殖抑制率持續(xù)下降，且呈現(xiàn)一定濃度依賴性。見圖4。

圖4 各組HeLa 細胞增殖抑制率Fig.4 Inhibitory rates of proliferation of HeLa cells in various groups

2.5 2 組HeLa 細胞凋亡率Annexin Ⅴ/PI 雙染后，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示：MSCs 處理48 h 后的宮頸癌HeLa 細胞凋亡率為（21.77%±2.51%），高于對照組（1.29%±0.88%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示MSCs 可誘導(dǎo)宮頸癌HeLa 細胞凋亡。見圖5。

圖5 2 組HeLa 細胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of HeLa cells in two groups

2.6 不同時間點各組HeLa 細胞中caspase-3 和P53 蛋白表達水平MSCs 處理HeLa 細胞0、24 和48 h 后，各組HeLa 細胞中caspase-3 和P53 蛋白表達水平持續(xù)升高，Bcl-2 蛋白表達水平持續(xù)降低，同一蛋白不同時間點的相對表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1 和圖6。

表1 各組細胞中caspase-3、P53 和Bcl-2 蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of caspase-3,P53 and Bcl-2 in HeLa cells in various groups (n=3，）

表1 各組細胞中caspase-3、P53 和Bcl-2 蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of caspase-3,P53 and Bcl-2 in HeLa cells in various groups (n=3，）

*P＜0.01 compared with 0 h；△P＜0.01 compared with 24 h.

圖6 MSCs處理0、24和48 h后HeLa細胞中caspase-3、P53 和Bcl-2 蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of caspase-3,P53 and Bcl-2 proteins in HeLa cells after treated with MSCs for 0,24,and 48 h

3 討論

宮頸癌是一種全球發(fā)病率僅次于乳腺癌的婦科惡性腫瘤，每年新增病例超過50 萬，病死率在婦科腫瘤中占比高達8%，對女性健康造成嚴重威脅［6-7］。既往宮頸癌治療以手術(shù)和放射治療為主，但即使醫(yī)療科技發(fā)展到今天，醫(yī)師手術(shù)技巧和放療技術(shù)均有長足進步，宮頸癌患者5 年生存率的提升幅度不甚理想，因此探索其他治療方法十分必要［8-9］。伴隨基因治療研究日益深入，干細胞理論日趨豐富，相關(guān)技術(shù)不斷完善，MSCs 憑借其獨特生物學(xué)特性，可向腫瘤組織進行特異性趨化，被募集于腫瘤處，發(fā)揮抗腫瘤作用，其在癌癥中的潛在治療價值引起學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注，但是否適用于宮頸癌臨床治療，有待深入研究。

有學(xué)者對宮頸癌細胞中側(cè)群細胞進行了富集、分選，發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞分化越差，側(cè)群細胞比例越低，且后者具備一定腫瘤干細胞特征，可作為宮頸癌干細胞治療的切入點［10］。目前臨床采用的MSCs多源自臍帶，本研究即從足月胎兒臍帶組織中分離獲得了可靠的臍帶MSCs 細胞，發(fā)現(xiàn)其黏附性較強，與宮頸癌HeLa 細胞共培養(yǎng)1 周后形態(tài)變?yōu)楸馄絾螌蛹毎崾綧SCs 培養(yǎng)成功，且MSCs 條件培養(yǎng)基濃度越高，宮頸癌HeLa 細胞集落形成能力越弱，建議選用20% 濃度的MSCs 條件培養(yǎng)基。本研究探討了MSCs 細胞與HeLa 細胞之間不同比例時對細胞增殖抑制率，結(jié)果顯示：伴隨MSCs 比例增加，HeLa 細胞增殖抑制率持續(xù)下降，呈現(xiàn)出濃度依賴性，提示不同濃度的MSCs 對于HeLa 細胞增殖的抑制能力不同，建議采取高濃度MSCs 細胞抑制宮頸癌HeLa 細胞毒性。其原因可能是MSCs 細胞可分泌一定量生物活性因子，間接殺死癌細胞，影響癌細胞信號通路，從而抑制癌細胞增殖；另外，還可能與細胞凋亡間存在一定關(guān)聯(lián)，MSCs 可能是通過激活凋亡基因，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，從而影響癌細胞周期，抑制癌細胞增殖。經(jīng)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：MSCs 處理48 h 后的宮頸癌HeLa 細胞早期凋亡率為21.77%，與單純宮頸癌HeLa 細胞比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示MSCs可誘導(dǎo)宮頸癌HeLa 細胞凋亡。

研究［11-12］證明：MSCs 對癌細胞生長有抑制作用，一方面可抑制癌細胞周期、促進癌細胞凋亡干擾癌細胞周期進程；另一方面還可通過分泌生物活性因子作用于癌細胞信號通路抑制癌細胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡。本研究選取多種細胞凋亡分子并進行檢測，結(jié)果顯示：MSCs 體外可上調(diào)促凋亡分子caspase-3 和P53 蛋白表達，下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達，最終促進HeLa 細胞凋亡。caspase 是存在于細胞質(zhì)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶，也是促使HeLa 細胞凋亡的主要調(diào)控蛋白［13］。caspase 分為2 類：一類是發(fā)揮啟動作用的促凋亡蛋白，如caspase-8 和caspase-9；另一類負責(zé)執(zhí)行促凋亡任務(wù)，如caspase-3［14-15］。P53 蛋白可調(diào)控細胞周期啟動，與細胞周期調(diào)控、細胞分化、DNA 修復(fù)和細胞凋亡等生物學(xué)功能有關(guān)［16-17］。p53 基因在宮頸癌HeLa 細胞中的表達被抑制，因而有學(xué)者認為可通過上調(diào)P53 蛋白而抑制HeLa 細胞增殖［18］。研究［19-20］表明：Bcl-2 蛋白屬于凋亡相關(guān)蛋白，其過度表達與多種上皮性腫瘤產(chǎn)生、進展存在密切關(guān)系，可使細胞在DNA 損傷的情況下持續(xù)生存。同時，既往研究［21］表明：Bcl-2 蛋白表達與宮頸癌細胞擴散直接相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：MSCs 對HeLa 細胞處理0、24 和48 h 后的caspase-3 和P53 蛋白相對表達水平持續(xù)升高，Bcl-2 蛋白相對表達水平持續(xù)降低，提示MSCs 可能通過上調(diào)caspase-3 和P53 蛋白表達，下調(diào)Bcl-2 蛋白表達，抑制宮頸癌HeLa 細胞毒性。

綜上所述，MSCs 體外抑制宮頸癌HeLa 細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，可能是通過上調(diào)caspase-3 和P53 蛋白表達、下調(diào)Bcl-2 蛋白表達實現(xiàn)的，該結(jié)果為MSCs 治療宮頸癌提供了理論依據(jù)，未來可更深一步研究，豐富MSCs 治療宮頸癌的實驗依據(jù)。