發(fā)酵紅參總皂苷對高糖培養(yǎng)大鼠心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞的保護作用及其機制

曲 萌 ,翁詩雅 ,鄭 鴻 ,李 焱 ,高潤澤 ,王勝告 ,于春艷,陳博學(xué),董志恒

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

心肌間質(zhì)纖維化（myocardial interstitial fibrosis，MIF）是糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）的主要病理變化，其發(fā)病機制復(fù)雜，高糖環(huán)境是引發(fā)MIF 的重要始動因素［1］。高糖和糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）等可促進心肌組織轉(zhuǎn)化生長因 子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）的表達。TGF-β1是一種公認(rèn)的致纖維化因子，參與調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的形成和降解，與心肌間質(zhì)纖維化關(guān)系密切。作為TGF-β1 的下游因子，TGF-β1 的多種生物學(xué)活性是通過Smads 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用來實現(xiàn)的［2-3］。UⅡ是一種生長抑素樣環(huán)肽，具有促進細(xì)胞增殖和ECM 表達的非血管效應(yīng)，其在心臟、腎臟和肺臟等臟器纖維化過程中可促 進TGF-β1 的表達［4-6］。有關(guān)U Ⅱ/ TGF-β1/Smads 信號通路在器官纖維化的作用已成為近年來研究的熱點。心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞（cardial interstitial fibroblasts，cFb）是MIF 的主要效應(yīng)細(xì)胞，在高糖等因素刺激下，cFb 細(xì)胞增殖并分泌大量膠原蛋白，進而引起MIF［7-8］。因此，尋找能夠抑制cFb 過度增殖的治療措施對防治DCM 具有重要意義。有別于西藥的靶點單一和不良反應(yīng)大等問題，目前中醫(yī)藥已成為治療DCM 的研究熱點。人參被稱為“百草之王”，具有廣泛的藥理活性，人參皂苷是其主要活性成分，至今為止，已分離出40 多種人參皂苷單體。人參皂苷及單體具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力和抗腫瘤等多種生物功效，能有效防治各類代謝性疾病和慢性疾病。紅參是人參的熟用品，與白參相比，具有新的活性成分，且其抗氧化和降血糖等生物活性明顯增強［9］。紅參經(jīng)發(fā)酵后，其皂苷發(fā)生轉(zhuǎn)換，新的活性物質(zhì)增多，活性成分較紅參更易被吸收。目前，有關(guān)發(fā)酵紅參及其活性成分對DCM 的研究國內(nèi)外鮮有報道。本研究以高糖培養(yǎng)下的大鼠cFb 細(xì)胞為研究對象，觀察發(fā)酵紅參總皂苷（fermented red ginseng total saponins，F(xiàn)RGTS）對cFb 細(xì)胞的影響，并初步探討其相關(guān)作用的分子機制，旨在進一步開發(fā)驗證紅參的藥效和藥物機制，為糖尿病（diabetes mellitus，DM）及其慢性并發(fā)癥的防治提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器1～3 d 齡SD 大鼠由吉林省藥品檢驗所實驗動物科提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2016-0003。發(fā)酵紅參總皂苷由吉林大學(xué)藥學(xué)院提供（皂苷含量73.4%），DMEM 培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（美國Gibco 公司），胰蛋白酶（美國Sigma 公司），鼠抗波形蛋白（vimentin）單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國BPB公司），實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（日本TaKaRa 公司），引物合成［生工生物工程（上海）有限公司］，鼠抗UⅡ、TGF-β1、Smad3 和Smad7抗體及羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz 公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。ABI RT-qPCR 儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），SpectraMax 190 型全波長酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司），熒光顯微鏡（日本Nikon 公司），電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司）。

1.2 cFb 細(xì)胞提取、鑒定和實驗分組選取1～3 d 齡SD 大鼠，在無菌條件下開胸剪取心臟，剝?nèi)バ陌ず螅肈-Hank’s 液漂洗2 次，剪成體積為0.5～1.0 mm3的組織碎塊，將組織碎塊打散后，在37 ℃水浴振蕩下，用0.25%胰酶液反復(fù)消化7次，每次10 min，收集每次消化上清液，加等量DMEM 培養(yǎng)液（含15% 胎牛血清），離心5 min（1 200 r·min－1），共2 次，棄上清液。加入DMEM培養(yǎng)液（含15%胎牛血清）重懸細(xì)胞，移至培養(yǎng)皿后，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育90 min，采用差速貼壁法去除未貼壁的心肌細(xì)胞，待細(xì)胞生長近融合狀態(tài)時按1∶2 消化傳代。依據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和免疫學(xué)表型（vimentin）確定是否為cFb細(xì)胞。實驗采用第2～3 代細(xì)胞，且在接受試劑干預(yù)前均先同步化。將實驗細(xì)胞分為正常糖對照組（5.5 mmol·L－1D-葡萄糖）、高糖組（25 mmol·L－1D-葡萄糖）、高糖＋15 mg·L－1FRGTS組（F15組）和高糖＋30 mg·L－1FRGTS 組（F30 組）。

1.3 MTT 法檢測各組cFb 細(xì)胞增殖活性取2～3 代處于對數(shù)生長期的cFb 細(xì)胞，用DMEM 低糖培養(yǎng)液（含15%胎牛血清），以1×104mL－1密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁后同步化，再根據(jù)上述分組處理細(xì)胞，每組設(shè)5 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h，并于預(yù)定時間點，每孔加入MTT溶液（5 g·L－1）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，此后吸棄孔內(nèi)上清液，每孔再加入150 μ L DMSO，震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物，酶標(biāo)儀490 nm 處測定各孔吸光度（A）值，以A 值表示各組cFb 細(xì)胞的增殖活性。

1.4 ELISA 法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平各組培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后以每孔1 000 個細(xì)胞的密度接種于培養(yǎng)板內(nèi)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h 后，換無血清的DMEM培養(yǎng)24 h 使其同步化。待細(xì)胞生長至70%～80%融合后，分組并加入條件培養(yǎng)基，于24 h 后收集培養(yǎng)液上清，按照ELISA 試劑盒說明書測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平，在450 nm 波長處依次測定各孔的A 值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程y=ax+b，計算各樣品中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平。

1.5 RT-qPCR 法檢測cFb 細(xì)胞中Smad3 和Smad7 mRNA 表達水平采用Trizol 法提取cFb 細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，通過RT-qPCR 儀進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)總體積20 μL，反應(yīng)條件及過程：95 ℃預(yù)變性10 min，（95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）×40 個循環(huán)，每個樣本設(shè)6 個復(fù)孔。引物序列：Smad3，上游引物5'-GCTGTCTACCAGTTGACTCGCAT-3'，下游引物5'-GGGTGCTGGTCACTGTCTGTCT-3'；Smad7，上游引物5'-TGTCCAGACGCTGTACCTTCCT-3'，下游引物 5'-AGTCTTCTCCTCCCAGTATGCCA-3'；GAPDH，上游引物5'-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3'，下游引物5'-GCCCAGGATGCCCTTTAGTG-3'。采 用2－ΔΔCt法計算各組細(xì)胞目的基因mRNA 表達水平，ΔΔCt=實驗樣品ΔCt－基準(zhǔn)樣品ΔCt。

1.6 Western blotting 法檢測各組cFb 細(xì)胞中UⅡ、TGF-β1、Smad3 和Smad7 蛋白表達水平各組細(xì)胞給予相應(yīng)條件刺激培養(yǎng)24 h 后，低溫提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白總濃度。每孔上樣30 μg 蛋白，采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離樣品，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，封閉阻斷后，分別用鼠抗UⅡ、TGF-β1、Smad3 和Smad7 一抗對膜進行免疫印跡，4 ℃孵育過夜。洗膜后滴加HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫雜交2 h，洗膜，將ECL 發(fā)光試劑盒A 液和B 液等比混勻，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影處理，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組cFb 細(xì)胞增殖活性，cFb 細(xì)胞中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平，Smad3 和Smad7 mRNA表達水平，UⅡ、TGF-β1、Smad3 和Smad7 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cFb 細(xì)胞形態(tài)觀察和免疫學(xué)鑒定倒置顯微鏡下觀察顯示：培養(yǎng)細(xì)胞多呈梭形或多角形，排列較密集，呈放射狀或漩渦狀分布。細(xì)胞體積較大，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形；免疫熒光染色結(jié)果顯示培養(yǎng)細(xì)胞vimentin 陽性。見圖1。

圖1 cFb 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（A）和免疫熒光染色鑒定（B）（×200）Fig.1 Morphology(A) and immunological fluorescence staining identification(B)of cFb（×200）

2.2 各組cFb 細(xì)胞增殖活性MTT 法檢測結(jié)果顯示：與正常糖對照組比較，高糖組cFb 細(xì)胞24 h 后增殖活性明顯升高（P＜0.01），培養(yǎng)48 h 后，其增殖活性升高更為明顯。與高糖組比較，F(xiàn)15 組和F30組cFb細(xì)胞增殖活性均有明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)30 組抑制作用強于F15 組。見表1。

表1 不同時間各組cFb 細(xì)胞的增殖活性Tab.1 Proliferation activities of cFb at different time in various groups（n=6，）

表1 不同時間各組cFb 細(xì)胞的增殖活性Tab.1 Proliferation activities of cFb at different time in various groups（n=6，）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal glucose control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs high glucose group.

2.3 各組cFb 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平與正常糖對照組比較，高糖組培養(yǎng)24 h的cFb 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平明顯升高（P＜0.01）。與高糖組比較，F(xiàn)15 組和F30 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），且F30 組降低作用優(yōu)于F15 組。見表2。

表2 各組cFb 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平Tab.2 Levels of collagen Ⅰand collagen Ⅲ proteins in supernatant of cFb in various groups [n=6，，ρB/（mg·L?1)]

表2 各組cFb 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平Tab.2 Levels of collagen Ⅰand collagen Ⅲ proteins in supernatant of cFb in various groups [n=6，，ρB/（mg·L?1)]

*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal glucose control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs high glucose group.

2.4 各組cFb 細(xì)胞中Smad3 和Smad7 mRNA 表 達水平與正常糖對照組比較，高糖組cFb 細(xì)胞中Smad3 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01），Smad7 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01）。經(jīng)FRGTS 干 預(yù)24 h 后，與高糖組比較，F(xiàn)15 組 和F30 組cFb 細(xì)胞中Smad3 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01），F(xiàn)30 組cFb 細(xì)胞中Smad7 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01）。見表3。

表3 各組cFb 細(xì)胞中Smad3 和Smad7 mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of Smad3 and Smad7 mRNA in cFb in various groups（n=6，）

表3 各組cFb 細(xì)胞中Smad3 和Smad7 mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of Smad3 and Smad7 mRNA in cFb in various groups（n=6，）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal glucose control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs high glucose group.

2.5 各組cFb 細(xì)胞中U Ⅱ、TGF-β1、Smad3 和Smad7 蛋白表達水平與正常糖對照組比較，高糖組cFb 細(xì)胞中UⅡ、TGF-β1 和Smad3 蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01），Smad7 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。加入FRGTS 干預(yù)24 h 后，與高糖組比較，F(xiàn)15 組和F30 組cFb 細(xì)胞中UⅡ、TGF-β1 和Smad3 蛋白表達水平降低（P＜0.05 或P＜0.01），而Smad7蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01），其中F30 組對高糖環(huán)境下上述指標(biāo)蛋白表達的調(diào)控作用優(yōu)于F15 組。見圖2 和表4。

圖2 各組cFb 細(xì)胞中UⅡ、TGF-β1、Smad3 和Smad7蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of UⅡ,TGF-β1,Smad3 and Smad7 proteins in cFb in various groups

表4 各組cFb 細(xì)胞中UⅡ、TGF-β1、Smad3 和Smad7 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of UⅡ,TGF-β1,Smad3 and Smad7 proteins in cFb in various groups（n=6，）

表4 各組cFb 細(xì)胞中UⅡ、TGF-β1、Smad3 和Smad7 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of UⅡ,TGF-β1,Smad3 and Smad7 proteins in cFb in various groups（n=6，）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal glucose control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs high glucose group.

3 討論

在DM 患者死亡原因中，約60%以上死于慢性心血管并發(fā)癥，心血管系統(tǒng)疾病已成為DM 患者的主要死亡原因。DCM 是獨立于冠心病、高血壓及其他已知心臟病的一種原發(fā)病，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷，導(dǎo)致廣泛的結(jié)構(gòu)和功能異常，引起心肌肥厚、舒縮功能障礙，最終進展為心力衰竭［10］。MIF 是DCM 的特征性結(jié)構(gòu)改變，主要表現(xiàn)為cFb細(xì)胞過度增殖、膠原纖維過量積聚和各型膠原蛋白比例失衡等心肌重塑變化［11］。心肌組織主要由心肌細(xì)胞和心肌間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，屬于永久性細(xì)胞，在心肌適應(yīng)修復(fù)過程中主要表現(xiàn)為細(xì)胞肥大。cFb 細(xì)胞是心肌組織中含量最多的細(xì)胞，連接細(xì)胞間質(zhì)并包繞心肌細(xì)胞，具有較強的分裂增殖能力，能合成和分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，其過度增殖和ECM 過度沉積是導(dǎo)致MIF的重要因素［12］。cFb 細(xì)胞在細(xì)胞因子激活、中間產(chǎn)物堆積、炎性介質(zhì)產(chǎn)生和高血糖相關(guān)的代謝功能紊亂等條件下合成和分泌大量的膠原蛋白等ECM，造成ECM 在心肌細(xì)胞間過度積聚，使心肌順應(yīng)性降低，心室壁僵硬，與心力衰竭的進展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：與正常糖對照組比較，高糖環(huán)境培養(yǎng)24 h 后cFb 細(xì)胞增殖能力明顯增加，培養(yǎng)48 h 后，高糖環(huán)境促cFb 細(xì)胞增殖的效應(yīng)更為明顯，高糖環(huán)境下培養(yǎng)24 h 的cFb 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平較正常糖對照組明顯增加，表明高糖可通過促進cFb 細(xì)胞增殖和增加ECM 產(chǎn)生等途徑促使MIF，高糖環(huán)境是引起DM心肌纖維化和心臟損傷的重要因素。

高糖促MIF 的分子信號調(diào)節(jié)機制十分復(fù)雜，目前尚未完全清楚。近年來研究結(jié)果［13］顯示：UⅡ具有絲裂原樣作用，可促進cFb 細(xì)胞增殖，并通過ERK1/2 和TGF-β1 等信號傳導(dǎo)通路促進cFb細(xì)胞膠原合成。UⅡ是一種廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的生長抑素樣環(huán)肽，除具有引起血管收縮的血流動力學(xué)作用外，還具有刺激細(xì)胞增殖和促進ECM表達等非血流動力學(xué)效應(yīng)［14］。研究［15］表明：1×10－10～1×10－6mol·L－1U Ⅱ均能刺 激cFb 細(xì)胞增殖。新生大鼠離體心肌研究［16］顯示：UⅡ刺激cFb細(xì)胞，促進Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白以及纖維連結(jié)蛋白的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，促進膠原合成。UⅡ基因位于的區(qū)域（1p32～p36）與DM 有關(guān)。WENYI等［17］研究發(fā)現(xiàn)：2 型DM（T2DM）患者UⅡ的89N 基因型頻數(shù)分布高于正常對照組，89N 與胰島素抵抗有關(guān)，易導(dǎo)致群T2DM發(fā)生。UⅡ的rs228648G/G型與漢族人群T2DM 的發(fā)生有關(guān)。DM 患者血漿UⅡ（hUⅡ）含量較正常人高1.7～1.8 倍，升高的血漿hUⅡ水平在無腎功能衰竭DM 患者的心血管并發(fā)癥中可能是一個重要因素。上述研究結(jié)果表明：DM 心血管損傷時可能增加UⅡ的產(chǎn)生和（或）減少了UⅡ的降解，UⅡ可能與DM 心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果也證實高糖環(huán)境下各組cFb 細(xì)胞中UⅡ蛋白表達水平明顯高于正常糖對照組。DAI 等［13］研究發(fā)現(xiàn)：在新生大鼠cFb細(xì)胞中，UⅡ能通過受體介導(dǎo)和時間依賴的方式增加TGF-β1 mRNA 及蛋白表達水平，并通過上調(diào)的TGF-β1 調(diào) 控U Ⅱ的致纖維化作用，提示U Ⅱ/TGF-β/Smads 信號傳導(dǎo)通路可能在DM 心肌損傷中發(fā)揮一定生物學(xué)效應(yīng)。

作為心臟的重要信號分子，TGF-β1 及其受體在心臟的心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞中均有表達。TGF-β1是諸多因素［血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）、內(nèi)皮素和去甲腎上腺素等］導(dǎo)致MIF 最后的共同中介物之一。DM 狀態(tài)下，高糖、AGEs、AngⅡ和血栓素A2 等均可誘導(dǎo)心臟TGF-β1 的活化及其受體表達增加。研究［18］證實TGF-β1 在人和動物DM 模型的心肌組織中活化。Smads 作為TGF-β1 的下游胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，TGF-β1 的 許多生物學(xué)效應(yīng)是通過Smads 的細(xì)胞核內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用來完成的［19］。Smads 按其生理功能可分為3 類，其中Smad1、2、3、5 和8 為受體調(diào)節(jié)Smad，轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β 超家族的信號；Smad6 和7 為抑制性Smad，對Smad 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用；Smad4 為協(xié)同Smad，是受體調(diào)節(jié)Smad 的信號伙伴［20］。此 外，Smads 還可由 非TGF-β1 途徑激活［21］。Smads 信號蛋白的激活分早期相和晚期相，TGF-β1 主要在晚期相激活Smads。由于Smads 能夠整合細(xì)胞內(nèi)不同信號途徑，常被認(rèn)為是對信號途徑進行精細(xì)調(diào)節(jié)的理想候選因子，是心臟從代償過程轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥斶^程的分子開關(guān)。目前國內(nèi)外對Smads 的研究主要集中于心力衰竭、心室重構(gòu)和糖尿病腎病等方面，而對其在DCM 病變發(fā)展過程中作用的相關(guān)研究報道甚少。本研究結(jié)果顯示：高糖環(huán)境下，各組cFb 細(xì)胞中Smad3 mRNA 表達水平較正常糖對照組明顯升高，Smad7 mRNA 表達較正常糖對照組明顯降低，各組cFb 細(xì)胞中TGF-β1和Smad3 蛋白表達水平較正常糖對照組明顯升高，Smad7 蛋白表達水平均明顯降低，提示UⅡ活化和TGF-β1/Smads 傳導(dǎo)通路激活在DCM 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

目前臨床上對于DCM 的診治尚不明確，早期的鑒別診斷較難，主要以對癥治療為主，延緩病變向心力衰竭發(fā)展。中醫(yī)藥在DM 及其慢性并發(fā)癥防治方面自古以來就發(fā)揮重要作用，尤其是近年來，采用中藥單體或有效成分治療DM 及其并發(fā)癥更是成為眾多學(xué)者研究的熱點。研究［22］表明：黃芪多糖和葛根素等可通過減少心肌細(xì)胞凋亡達到保護心肌的作用。人參果皂苷聯(lián)合九里香葉總黃酮通過抗氧化對大鼠糖尿病心肌病具有保護作用［23］。三七皂苷R1 可通過抑制TGF-β1/Smad3 信號通路來調(diào)節(jié)DM 大鼠腎臟纖維化［24］。紅芪多糖可減輕DM小鼠心肌損傷，防治間質(zhì)纖維化［25］。人參是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有皂苷、糖類、生物堿、氨基酸和多肽等多種活性成分，其中皂苷類為其主要活性成分。人參皂苷屬于三萜類皂苷，分為人參皂苷二醇型（Rb1、Rd、Rb2、Rh2 和Rc 等）、人參皂苷三醇型（Rg1、Re、R2、Rf 和Rh1 等）和齊墩果酸型（R3、Ri 和Ro 等），其中人參皂苷二醇型和人參皂苷三醇型在人參含量相對較高。研究［26-27］證實：人參皂苷在DM 的治療中具有調(diào)節(jié)血糖和血脂水平，改善胰島素抵抗，抗氧化，提高機體免疫力，改善腎臟功能等作用。紅參是人參的熟用品，經(jīng)蒸制發(fā)酵后，其皂苷種類和含量發(fā)生明顯的變化，總皂苷Re、Rb1 和Rg1 等含量逐漸降低，稀有皂苷Rg3、Rh1 和Rh2 等含量逐漸增加，生物活性增強。本研究以高糖培養(yǎng)下的大鼠cFb 細(xì)胞為研究對象，觀察發(fā)酵紅參總皂苷對cFb 細(xì)胞的影響，結(jié)果表明：與高糖組比較，發(fā)酵紅參總皂苷各劑量干預(yù)組cFb 細(xì)胞增殖活性均明顯降低，同時隨作用時間延長，抑制效應(yīng)更加明顯；發(fā)酵紅參總皂苷干預(yù)24 h 后，cFb 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平較高糖組明顯降低，cFb 細(xì)胞中U Ⅱ和TGF-β1 蛋白表達水平下降，Smad3 mRNA 和蛋白表達下調(diào)，Smad7 mRNA和蛋白表達上調(diào)，且F30組對高糖環(huán)境下上述指標(biāo)表達的調(diào)控作用優(yōu)于F15 組。

綜上所述，高糖環(huán)境是造成DM 心肌損傷的主要因素，發(fā)酵紅參總皂苷能有效抑制高糖所致的纖維化效應(yīng)，保護DM 大鼠心肌，其機制可能通過阻抑cFb 細(xì)胞UⅡ活化，調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads 傳導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。