N-乙酰半胱氨酸對高尿酸血癥大鼠氧化應激和血管內皮功能的影響及其機制

王興華,楊洪娟,胡秀紅,崔紅蕊,徐保振,李丹露,王 濤,高玉偉

（河北醫科大學第一醫院中西醫結合腎內科，河北 石家莊 050031）

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是因嘌呤代謝障礙導致體內尿酸產生過多和（或）排泄過少引起的一種代謝性疾病。HUA 不僅是導致痛風發生的直接原因，也是引發心血管疾病的獨立危險因素［1］。研究［2］證實：HUA 可導致機體氧化應激水平升高，減少一氧化氮（nitric oxide，NO）的產生，引起血管內皮功能紊亂。血管內皮功能障礙是導致高血壓、動脈粥樣硬化和心力衰竭等心血管疾病的重要始動因素［3］。因此有效控制氧化應激介導的血管內皮損傷，是降低HUA 繼發性心血管疾病發病風險的重要措施。N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）是一種還原型谷胱甘肽前體，具有較強的抗炎和抗氧化作用，臨床上廣泛應用于呼吸系統、消化系統和心血管系統等疾病的治療［4］。多項研究［5-7］表明：NAC 可通過降低氧化應激水平和維持內皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性等途徑抑制內皮細胞損傷，改善血管內皮功能障礙，但NAC 對HUA 相關氧化應激及血管內皮功能的影響尚不清楚。本研究通過構建HUA 大鼠模型，探討NAC 對HUA 大鼠氧化應激和血管內皮功能的影響，為臨床早期積極預防HUA 繼發性心血管疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠60只，6周齡，體質量（230±20）g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（冀）2018-1-003。飼養溫度24 ℃～26 ℃，相對濕度45%～60%，晝夜12 h 循環照明，自由飲水和進食。NAC 和氧嗪酸鉀均購自美國Sigma-Aldrich 公司，羧甲基纖維素鈉購自南京化學試劑有限公司，尿酸（uric acid，UA）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCr）、NO、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，內皮素1（endothelin-1，ET-1）ELISA 試劑盒購自浙江聯碩生物技術有限公司，過氧化氫酶（catalase，CAT）活性檢測試劑盒和免疫組織化學試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，eNOS 單克隆抗體購自英國Abcam 公司。動物生化分析儀（型號：iMagic-V7）購自深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司，酶標儀（型號：K3）購自美國Thermo 公司。

1.2 實驗動物模型構建和分組采用隨機數字表法將60 只大鼠分為對照組、模型組、低劑量NAC組和高劑量NAC 組，每組15 只。除對照組外，其他各組大鼠采用氧嗪酸鉀灌胃法［8］建立HUA 模型：首先將氧嗪酸鉀溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中備用，隨后給予大鼠750 mg·kg－1氧嗪酸鉀溶液灌胃，對照組大鼠給予等量羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，灌胃容積0.5 mL·100 g－1，每天灌胃1 次，連續4 周，并以大鼠血清UA 水平高于對照組1.5～3.0 倍［9］提示HUA 造模成功。造模成功后，低和高劑量NAC 組大鼠分別給予75 和300 mg·kg－1NAC 灌胃，對照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，每天1 次，連續干預4 周。

1.3 標本采集干預4 周后，30 mg·kg－1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，抽取腹主動脈血5～8 mL，3 000 r·min－1離心15 min，取血 清－80 ℃保存待測。分離大鼠胸主動脈，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

1.4 各組大鼠血清中生化指標檢測取保存的各組大鼠血清，根據試劑盒說明書采用酶比色法檢測大鼠血清中UA 水平，脲酶法檢測大鼠血清中BUN 水平，肌氨酸氧化酶法檢測大鼠血清中Scr 水平，比色法檢測大鼠血清中NO 水平，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠血清中ET-1 水平。

1.5 各組大鼠血清中氧化應激指標檢測取各組大鼠血清，根據試劑盒說明書采用硫代巴比妥酸（TAB）法檢測各組大鼠血清中MDA 水平，羥胺法檢測各組大鼠血清中T-SOD 活性，比色法檢測各組大鼠血清中GSH-Px 活性，微量法檢測各組大鼠血清中CAT 活性。

1.6 免疫組織化學法檢測各組大鼠胸主動脈組織中eNOS 表達水平取出石蠟包埋的大鼠胸主動脈組織，制成厚度4 μm 切片，60 ℃烘片2 h，梯度乙醇復水，置于10 μmol·L－1檸檬酸鈉溶液中沸水浴修復抗原，3% H2O2室溫避光封閉10 min，滴加山羊血清封閉30 min，滴加eNOS 抗體（1∶50）于4 ℃條件下孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色3 min，蘇木精復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡觀察。每張切片在400 倍鏡下隨機選取3 個視野，陽性染色呈棕色或棕褐色，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定陽性表達區域光密度（OD）值，計算平均OD 值，平均OD 值=測量區域OD 值/測量區域面積，以平均OD 值表示胸主動脈組織中eNOS 表達水平。

1.7 統計學分析采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。各組大鼠血清中UA、BUN、Scr、ET-1、NO 和MDA 水平，T-SOD、CAT 和GSH-Px 活性，大鼠胸主動脈組織中eNOS 表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中UA、BUN 和Scr 水平與對照組比較，模型組大鼠血清中UA 水平升高（P＜0.05），而BUN 和Scr 水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，高劑量NAC 組大鼠血清中UA 水平降低（P＜0.05），但BUN 和Scr 水平差異無統計學意義（P＞0.05），低劑量NAC 組大鼠血清中UA、BUN 和Scr 水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清中UA、BUN 和Scr 水平Tab.1 Levels of UA,BUN and Scr in serum of rats in various groups (n=15，-)

表1 各組大鼠血清中UA、BUN 和Scr 水平Tab.1 Levels of UA,BUN and Scr in serum of rats in various groups (n=15，-)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

2.2 各組大鼠血清中氧化應激指標與對照組比較，模型組大鼠血清中T-SOD、CAT 和GSH-Px活性降低（P＜0.05），而MDA 水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量NAC 組大鼠血清中T-SOD、CAT 和GSH-Px 活性升高（P＜0.05），而MDA 水平降低（P＜0.05），低劑量NAC 組大鼠血清中各氧化應激指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中氧化應激指標活性和水平Tab.2 Activities and levels of oxidative stress indexes in serum of rats in various groups（n=15，-）

表2 各組大鼠血清中氧化應激指標活性和水平Tab.2 Activities and levels of oxidative stress indexes in serum of rats in various groups（n=15，-）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

2.3 各組大鼠血清中ET-1 和NO 水平與對照組比較，模型組大鼠血清中ET-1 水平升高（P＜0.05），NO-1 水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量NAC 組大鼠血清中ET-1 水平降低（P＜0.05），NO-1 水平升高（P＜0.05），而低劑量NAC 組大鼠血清中ET-1 和NO-1 水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清中ET-1 和NO 水平Tab.3 Levels of ET-1 and NO in serum of rats in various groups (n=15，-)

表3 各組大鼠血清中ET-1 和NO 水平Tab.3 Levels of ET-1 and NO in serum of rats in various groups (n=15，-)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

2.4 各組大鼠胸主動脈組織中eNOS 表達水平對照組和高劑量NAC 組大鼠胸主動脈組織中eNOS 陽性表達（呈棕色或棕褐色）較強，而模型組和低劑量NAC 組大鼠胸主動脈組織中eNOS 陽性表達較弱，見圖1。對照組、模型組、低劑量NAC 組和高劑量NAC 組大鼠胸主動脈組織中eNOS 表達水平分別為0.107±0.016、0.027±0.015、0.029±0.008 和0.096±0.009，各組間比較差異有統計學意義（F=114.611，P＜0.05）；其中，模型組大鼠胸主動脈組織中eNOS 表達水平低于對照組（P＜0.05），高劑量NAC 組大鼠胸主動脈組織中eNOS 表達水平高于模型組（P＜0.05），而低劑量NAC 組與模型組大鼠胸主動脈組織中eNOS 表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 免疫組織化學染色觀察各組大鼠胸主動脈組織中eNOS 表達情況（×200）Fig.1 Expressions of eNOS in thoracic aorta tissue of rats in various groups observed by immunohistochemical staining(×200)

3 討論

隨著人們生活水平的提高，含嘌呤類食物攝入量逐漸增加，HUA 發病率也逐年升高。流行病學調查研究結果［10］顯示：我國成年人HUA 發病率為13.0%，男性HUA 發病率遠高于女性。心血管疾病是威脅人類健康的第一大殺手，已有研究［1，11］證實：HUA 是心血管疾病的獨立危險因素。嘌呤代謝障礙產生過多尿酸的同時也會產生大量氧自由基，引起持續性的氧化應激反應，誘導內皮功能障礙及血液流變學的改變，導致心血管疾病的發生。研究［12］顯示：HUA 患者血清脂質過氧化物水平升高，而抗氧化物酶活性降低。動物實驗［13］結果表明：抑制機體氧化應激水平可改善HUA 大鼠血管損傷及病變。因此，降低機體氧化應激水平可能對預防或治療HUA 繼發性心血管疾病有重要意義。本研究結果顯示：NAC 干預不僅可以降低HUA 大鼠血清中UA 水平，還可提高HUA 大鼠體內抗氧化物酶活性，降低氧化應激水平，改善血管內皮功能。

尿酸酶是一種特異性分解UA 的生物酶，當體內尿酸酶缺失或UA 腎排泄功能受損時，血尿酸水平會升高，導致HUA。而氧嗪酸鉀是一種尿酸酶抑制劑，是目前應用最廣泛的HUA 動物模型誘導劑，其可抑制尿酸酶對UA 的分解，造成體內血清UA 濃度增加，形成 HUA 。本研究采用750 mg·kg－1氧嗪酸鉀溶液灌胃構建HUA 大鼠模型，結果顯示：模型組大鼠血清中UA 水平較對照組升高，表明HUA 模型構建成功，而采用NAC 干預后HUA 大鼠血清中UA 水平明顯降低，提示NAC 可降低血清中UA 水平。腎臟作為UA 的主要排泄器官，長期高濃度UA 會在腎小管和腎間質處形成尿酸鹽結晶并沉積，引起以腎小管及腎間質損傷為主的腎功能障礙［14］，因此腎臟相關疾病也是HUA 的常見并發癥。但本研究結果顯示：各組大鼠血清中腎功能指標BUN 和Scr 水平無明顯改變，說明本研究選擇的HUA 造模方法對大鼠腎功能無明顯影響，與李媛媛等［15］研究結果一致，可能與造模過程中氧嗪酸鉀給藥方式及給藥劑量有關。此外，HUA 導致腎損傷的發生是一個慢性過程，且臨床上也存在大量HUA 患者無腎功能異常表現。

研究［16-17］表明：HUA 與機體氧化-抗氧化失衡有密切關聯。機體抗氧化防御系統主要由T-SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶組成，而MDA 是機體脂質過氧化過程的代謝產物，能反映機體過氧化損傷程度。為此，本研究通過檢測血清中T-SOD、GSH-Px、CAT 和MDA 水平評估HUA 大鼠氧化應激水平，結果顯示：HUA 模型組大鼠血清中抗氧化物酶T-SOD、GSH-Px 和CAT 活性明顯降低，而MDA 水平明顯升高，表明HUA 大鼠體內存在較高的氧化應激水平。NAC 作為氧自由基清除劑和谷胱甘肽前體，已被廣泛應用于臨床呼吸系統、心血管和神經系統等疾病的治療。研究［18-19］顯示：NAC 的抗氧化效果明顯，能夠明顯提高機體抗氧化能力，改善氧化應激損傷。本研究結果顯示：高劑量NAC 干預可提高HUA 大鼠血清中抗氧化物酶T-SOD、GSH-Px 和CAT 活性，降低MDA 水平，說明NAC 能夠降低HUA 大鼠體內氧化應激水平。

研究［20］表明：UA 可以通過降低NO 的生物利用度，從而誘導血管內皮細胞功能障礙，其機制與超氧化物水平升高有關。嘌呤代謝障礙產生UA 的同時也會產生大量氧自由基，而氧自由基可與NO反應形成過氧硝酸鹽，從而降低血液中NO 濃度。NO 是介導內皮依賴性血管舒張功能的活性物質，主要由內皮細胞中L-精氨酸經eNOS 催化合成，具有抑制血小板聚集，舒張血管張力，抑制血管平滑肌細胞增殖等作用，而ET-1 則是最強的縮血管活性多肽，與NO 作用相反，二者動態平衡共同維持血管正常功能。研究［21］顯示：HUA 患者血清中NO水平明顯降低，而ET-1水平明顯升高。尤楊等［22］研究也顯示：高尿酸血癥大鼠血清中NO 水平明顯降低，而ET-1 水平明顯升高。本研究結果顯示：HUA 大鼠血清中NO 水平和胸主動脈組織中eNOS表達水平降低，而血清ET-1 水平升高，表明HUA可造成血管內皮損傷；采用NAC 干預后HUA 大鼠血清中NO 水平和胸主動脈組織中eNOS 表達水平均升高，而ET-1 水平降低，說明NAC 對HUA 導致的血管內皮損傷具有改善作用。NOGUEIRA等［23］研究也表明：NAC 可通過恢復NO 生物利用度來控制機體氧化應激水平，從而改善機體器官損傷。

綜上所述，NAC 可降低HUA 大鼠血清中UA水平，提高機體抗氧化能力，改善血管內皮功能，其作用機制可能與促進eNOS 表達，提高NO 生物利用度有關。