鹿茸多肽對輕度認知功能障礙大鼠學習記憶能力的改善作用及其調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1 信號通路的機制

黃曉巍 ,劉玥欣 ,王晉冀 ,許佳明 ,唐秋竹 ,林 賀 ,任吉祥,蘭天野

（1.長春中醫(yī)藥大學藥學院臨床藥學與中藥藥理教研室，吉林 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學藥學院實驗實訓中心，吉林 長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學創(chuàng)新實踐中心藥品檢驗實訓教研室，吉林 長春 130117；4.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院治未病中心，吉林 長春 130021；5.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腦病中心，吉林 長春 130021）

輕度認知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）是正常人體轉(zhuǎn)變?yōu)榘柎暮Ｄ。ˋlzheimer’s disease，AD）的過渡階段，由于AD 是不可逆轉(zhuǎn)的，因此對MCI 進行早期干預，對于降低AD 的發(fā)病率具有重要意義［1-4］。花鹿茸為梅花鹿的雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，是吉林省的道地藥材，鹿茸具有壯腎陽和益精血等功效［5］。VAP（velvet antler polypeptide，VAP）是鹿茸的主要有效成分之一，包含多種生長因子，具有良好的藥理作用和保健功效［6］。研究［7］表明：MCI 的發(fā)生常與機體氧化應激反應相關。KELCH 狀ECH相關蛋白 1（KELCH-like ECH-associated protein 1，Keap1）、核因子E2 相關因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）和血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是Keap1/Nrf2/HO-1氧化應激信號通路上的相關作用靶點［8］，而VAP具有抗氧化應激作用，但其是否通過Keap1/Nrf2/HO-1 信號通路改善MCI 有待進一步研究［9］。本研究采用腹腔中注射東莨菪堿的方法誘導制備MCI大鼠模型，通過觀察VAP 對模型大鼠海馬組織中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平的影響，探討其相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器Wistar 清潔級大鼠50 只，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，購于億斯實驗動物技術有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-（吉）-2018-0007；梅花鹿鹿茸（珍源鹿業(yè)有限公司，批號：20180325），VAP（長春中醫(yī)藥大學藥學院制備，每1 g 約含生藥28.7 g），吡拉西坦片（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：6190901），東莨菪堿（阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：D172511B），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平檢測試劑盒（酶免實業(yè)有限公司，批號：MM-0386R1、MM-0385R1），Keap1、Nrf2、GAPDH 一抗和HRP 二抗（北京索萊寶科技有限公司，批號：K106685P、K008925P、K200057M和10494-1-AP），彩虹245 廣譜蛋白Marker、全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 化學發(fā)光法檢測試劑盒和凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：PR1920、BC3711、PC0020、SW2010和P1200-2）；Morris 水迷宮及行為學分析系統(tǒng)（泰盟科技有限公司，型號：WMT-100S），組織包埋機（泰維科技實業(yè)有限公司，型號：TB-718D），顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：CKX41），酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司，型號：Multiskan FC），電泳儀、電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司，型號：BE6085），熒光發(fā)光凝膠成像儀（瑞士Tecan 公司，型號：Alliance Q9），4 ℃低溫離心機（德國艾本德股份公司，型號：Centrifuge 5810R），－80 ℃超低溫冰箱（美國賽默飛世爾科技公司，型號：ULT1386-3-V41）。

1.2 實驗動物分組、給藥和造模將50 只大鼠隨機分為正常對照組、MCI 組、吡拉西坦組、低劑量VAP 組和高劑量VAP 組。正常對照組和MCI 組大鼠灌胃等體積生理鹽水，吡拉西坦組大鼠灌胃500 mg·kg－1吡拉西坦，低劑量VAP 組大鼠灌胃200 mg·kg－1VAP，高劑量VAP 組大鼠灌胃300 mg·kg－1VAP 。動物造模時除正常對照組外其他組在灌胃給藥18 d 后2 h 腹腔中注射東莨菪堿2 mg·kg－1。

1.3 Morris 水迷宮實驗于給藥第11～17 天給藥2 h 后進行適應性實驗，將動物任意位置放入水迷宮，明確動物逃避潛伏期、行為路徑、穿過平臺位置次數(shù)和有效區(qū)停留時間，適應性實驗中，如動物在水迷宮中時間超過60 s，則引導動物到達平臺，并讓動物在平臺上停留10 s。于給藥第18 天給藥2 h 后進行正式實驗，記錄各組動物逃避潛伏期、行為路徑、穿過平臺位置次數(shù)和有效區(qū)停留時間。結(jié)束后，采用3%戊巴比妥鈉（35 mg·kg－1）對各組大鼠進行麻醉，用無菌注射器在腹部主動脈進行取血8 mL，4 000 r·min－1離心8 min，吸取上層血清，－80 ℃密封保存，用于后續(xù)ELISA 法檢測；處死各組大鼠，摘取大鼠腦組織，分離出海馬區(qū)，分別放于含4%組織固定液的瓶中，于4 ℃避光保存，用于后續(xù)HE 染色。其中部分組織于－80 ℃保存，用于后續(xù)Western blotting 法分析。

1.4 大鼠海馬組織HE 染色大鼠海馬組織進行脫水處理后，利用軟蠟進行包埋，冷凍后切片，厚度7 μm，染液處理完成后，顯微鏡觀察各組大鼠海馬組織的細胞形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 ELISA 法測定各組大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平依照檢測試劑盒具體要求進行操作，檢測各組大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平。

1.6 Western blotting 法檢測各組大鼠海馬組織中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平提取大鼠海馬組織總蛋白后定量至濃度為2 g·L－1；在蛋白樣品中按比例放入2 倍樣品緩沖液并充分混合，100 ℃中密閉放置加熱5 min，待降至室溫時，備用。制備10% SDS-PAGE 凝膠電泳，每孔20 μL 上樣，100 V 恒定電流轉(zhuǎn)至PADF 膜60 min，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，加入適宜濃度的Keap1、Nrf2 和HO-1 抗體，4 ℃條件下孵育24 h，清洗后加入二抗（1∶2 000，選用5%脫脂奶粉稀釋），封閉液中浸泡2 h，顯色劑處理后，熒光發(fā)光凝膠成像儀中進行定影，測定蛋白條帶的灰度值。采用Image J 圖像處理軟件對蛋白條帶進行分析。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。水迷宮實驗中各組大鼠逃避潛伏期、行為路徑、穿過平臺位置次數(shù)和有效區(qū)停留時間，血清中SOD 活性和MDA 水平，大鼠海馬組織中Keap1、Nrf2 和HO-1 表達水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris 水迷宮實驗檢測指標與正常對照組比較，MCI 組大鼠逃避潛伏期和行為路徑明顯升高（P＜0.01），穿過平臺位置次數(shù)和有效區(qū)停留時間明顯降低（P＜0.01）。與MCI 組比較，吡拉西坦組、低劑量VAP 組和高劑量VAP 組大鼠逃避潛伏期明顯降低（P＜0.01），吡拉西坦組和高劑量VAP 組大鼠行為路徑明顯縮短（P＜0.01），吡拉西坦組、低劑量VAP 組和高劑量VAP 組大鼠穿過平臺位置次數(shù)和有效區(qū)停留時間明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠Morris 水迷宮實驗結(jié)果Tab.1 Results of Morris water maze test of rats in various groups (n=10,)

表1 各組大鼠Morris 水迷宮實驗結(jié)果Tab.1 Results of Morris water maze test of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs MCI group.

2.2 各組大鼠海馬組織HE 染色結(jié)果正常對照組大鼠海馬組織中細胞形態(tài)相對完整，且排列有序。MCI 組大鼠海馬組織中細胞數(shù)量明顯減少，且排列方式和正常對照組相比由有序變?yōu)橄鄬靵y。吡拉西坦組和高劑量VAP組大鼠海馬組織中的細胞排列較MCI組相對整齊，形態(tài)也略規(guī)則。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織HE 染色結(jié)果（×200）Fig.1 HE staining results of hippocampus tissue of rats in various groups（×200）

2.3 各組大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平與正常對照組比較，MCI 組大鼠血清中SOD 活性明顯降低（P＜0.01），MDA 水平明顯升高（P＜0.01）；與MCI 組比較，吡拉西坦組和高劑量VAP組大鼠血清中SOD 活性明顯升高（P＜0.01），MDA 水平明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平Tab.2 SOD activities and MDA levels in serum of rats in various groups (n=10,)

表2 各組大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平Tab.2 SOD activities and MDA levels in serum of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.01 vs MCI group.

2.4 各組大鼠海馬組織中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平與正常對照組比較，MCI 組大鼠海馬組織中Keap1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與MCI 組比較，吡拉西坦組、低劑量VAP 組和高劑量VAP 組大鼠海馬組織中Keap1 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01），Nrf2和HO-1蛋白表達水平均有明顯升高（P＜0.01）。見圖2 和表3。

表3 各組大鼠海馬組織中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of Keap1,Nrf2,and NO-1 in hippocampus tissue of rats in various groups (n=10,)

表3 各組大鼠海馬組織中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of Keap1,Nrf2,and NO-1 in hippocampus tissue of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.01 vs MCI group.

圖2 各組大鼠海馬組織中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of Keap1,Nrf2,and NO-1 proteins in hippocampus tissue of rats in various groups

3 討論

由于我國人口呈老齡化趨勢，與其相關疾病引起廣泛關注。MCI 被認為是易患AD 的高風險人群，故正確認識MCI 并盡早對MCI 進行干預，能更好地防止AD 發(fā)生［10］。Keap1/Nrf2/HO-1 信 號通路是經(jīng)典的抗氧化應激信號通路，在人體中發(fā)揮抗氧化反應的關鍵作用。MCI 的產(chǎn)生與機體內(nèi)的氧化應激反應有密切關聯(lián)［8］。

本實驗中采用的造模藥物為東莨菪堿，其為中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑，可通過在毒蕈堿乙酰膽堿受體充當競爭性拮抗劑發(fā)揮其效用，從而造成相應病理變化。膽堿能活動在記憶和認知功能中起重要作用，研究［11-13］表明：膽堿能活性下降會導致相關遞質(zhì)含量下降，致使MCI 患者大腦中的海馬組織等膽堿能神經(jīng)元受損明顯。故本研究采用此方法進行造模。本研究結(jié)果表明：VAP 能夠抑制模型大鼠海馬組織中Keap1 表達、促進Nrf2 和HO-1 表達。在氧化應激下，Keap1/Nrf2 生成停止，Nrf2移位胞核，然后通過巨噬細胞活化因子形成異源二聚體，與靶基因內(nèi)的抗氧化反應元件進行點位結(jié)合［14-16］。進一步調(diào)節(jié)Ⅱ相解毒酶等靶基因相關活性，從而將ROS 等有害物質(zhì)加以清除。HO-1 是Ⅱ相解毒酶之一，此蛋白引起的下級反應能夠保護多種臟腑器官，避免其出現(xiàn)氧化應激現(xiàn)象［17-19］；VAP 可通過調(diào)節(jié)模型大鼠體內(nèi)Keap1/Nrf2/HO-1信號通路，產(chǎn)生抗氧化應激作用，增加SOD活性，抑制MDA產(chǎn)生。降低MDA水平能夠減少蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)間的交聯(lián)聚合現(xiàn)象，降低細胞的毒性傷害。SOD屬于抗氧化金屬酶之一，具有對超氧陰離子自由基歧化的催化作用，從而可以生成氧和過氧化氫。當抗氧化應激作用產(chǎn)生后，機體會抑制MDA 水平升高，促進SOD 生成，從而抵抗氧化應激損傷［20］。本研究結(jié)果顯示：VAP 能夠增強由東莨菪堿引起的MCI 實驗模型大鼠學習和記憶能力，增加大鼠體內(nèi)SOD 活性，同時減少MDA 產(chǎn)生，提高大鼠海馬組織中Nrf2 和HO-1 表達，抑制Keap1 表達，提示VAP 改善MCI 模型大鼠的作用機制可能與調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1 信號通路有關。