PRPS2 表達(dá)特點(diǎn)及其與乳腺癌預(yù)后關(guān)系的生物信息學(xué)分析

于 洋 ,劉賽男 ,劉云愷 ,李 勇 ,喬乙春 ,程 熠

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021）

乳腺癌現(xiàn)已成為威脅女性健康的惡性腫瘤［1］。目前按照分子分型不同，將乳腺癌大致分為4 種：Luminal A 型（ER+/PR+/HER2－）、Luminal B型（ER+/PR－/HER2－）、HER2 陽性型和三陰性乳腺癌（ER－/PR－/HER2－）［2］。嘌呤代謝產(chǎn)物不僅充當(dāng)DNA 和RNA 的基礎(chǔ)，而且還為細(xì)胞提供了必要的能量和輔助因子，以促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。腫瘤細(xì)胞如何調(diào)節(jié)嘌呤需求與腫瘤預(yù)后的關(guān)系密切。在高嘌呤需求的細(xì)胞條件下，嘌呤的從頭合成酶聚集在線粒體和微管附近，形成嘌呤體（purinosome）［3］。磷酸核糖焦磷酸合成酶（phosphoribosyl-pyrophosphate synthetase，PRPS）是將5-磷酸核糖（ribose-5-phophate，R5P）催化合成5-磷酸核糖-1-焦磷酸（5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate，PRPP）的限速酶［4］。上調(diào)PRPS2表達(dá)調(diào)節(jié)核苷酸生物合成對(duì)髓細(xì)胞組織增生（myelocytomatosis，MYC）驅(qū)動(dòng)的腫瘤發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要［5］，PRPS2 沉默阻斷嘌呤核苷酸從頭合成，能有效降低乳腺癌細(xì)胞的干性并減少肺轉(zhuǎn)移［6］，提示PRPS2 的表達(dá)可能與乳腺癌預(yù)后有關(guān)。本研究采用生物信息學(xué)聯(lián)合分析方法，探索乳腺癌患者中PRPS2 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 PRPS2 的轉(zhuǎn)錄分析采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn）［7］，將Log2（FC）的絕對(duì)值定義為1，P值的閾值定義為0.01，根據(jù)GTEx 和TCGA 數(shù)據(jù)研究泛乳腺癌和正常乳腺組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平。使用UALCAN 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步研究PRPS2 在不同年齡、是否絕經(jīng)、不同分子亞型、不同組織亞型、不同病理分級(jí)和是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0：沒有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N1：評(píng)分為1～3 分的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、N2：評(píng)分為4～9 分的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N3：評(píng)分≥10 分的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）等乳腺癌患者中的表達(dá)水平。

1.2 PRPS2 的預(yù)后分析采用Kaplan-Meier plotter（https：//kmplot.com）［8］數(shù)據(jù)庫研究PRPS2與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。條件如下：①乳腺癌；②按照PRPS2 mRNA 表達(dá)水平的中位數(shù)對(duì)患者進(jìn)行分組；③選擇無復(fù)發(fā)生存率（recurrence-free survival，RFS）作為結(jié)局指標(biāo)；④采用全部隨訪閾值；⑤以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 PRPS2 共表達(dá)基因的鑒定和富集分析采用cBioPortal（http：//cbioportal.org）［9］鑒 定PRPS2的共表達(dá)基因，采用Metascape（http：//metascape.org/）對(duì)在cBioPortal 數(shù)據(jù)庫中獲取的PRPS2 的共表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology Biological Processes，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，為研究PRPS2 在乳腺癌中潛在的生物學(xué)機(jī)制提供線索。

1.4 靶向PRPS2 3'UTR 的miRNA 預(yù)測(cè)及其在乳腺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)基于與目標(biāo)基因3'UTR 結(jié)合的miRNA 水平是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)水平高低的重要因 素，采 用miRTarBase（http：//miRTarBase.cuhk.edu.cn/）［10-11］數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)與PRPS2 3'UTR 結(jié)合的miRNAs，采用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫（https：//kmplot.com）研究靶向PRPS2 3'UTR 的miRNA 對(duì)乳腺癌的預(yù)后價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 泛乳腺癌和正常乳腺組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫研究乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示：RNA 池中PRPS2 每百萬轉(zhuǎn)錄本比例（transcripts per million，TPM）在泛乳腺癌患者癌組織和正常乳腺組織中差異明顯（圖1A）。泛乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平高于正常乳腺組織（P＜0.01）（圖1B）。

圖1 泛乳腺癌患者癌組織和正常乳腺組織中PRPS2 mRNA表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of PRPS2 mRNA in cancer tissue of pan-breast cancer patients and normal breast tissue

采用UALCAN 數(shù)據(jù)庫研究不同臨床病理特征、不同年齡、絕經(jīng)前后和不同病理分級(jí)的乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)情況，結(jié)果顯示：①與正常組織比較，在Luminal、HER2 陽性和三陰性乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（圖2A）；②與正常組織比 較，浸潤(rùn)性導(dǎo)管乳腺癌（invasive ductal carcinoma，IDC）、浸潤(rùn)性小葉乳腺癌（invasive lobular carcinoma，ILC）、混合型乳腺癌（mixed carcinoma）、黏液性乳腺癌（mucinous）、化生性乳腺癌（metaplastic）、髓質(zhì)乳腺癌（medullary）和其他未分類乳腺癌（others）患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（圖2B）；③與正常組織比較，絕經(jīng)前、中和后乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（圖2C）；④與正常組織比較，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（圖2D）；⑤與正常組織比較，各年齡段乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（圖2E）；⑥與正常組織比較，不同病理分級(jí)乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（圖2F）。

圖2 在乳腺癌不同臨床階段PRPS2 的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of PRPS2 in different courses of breast cancer

2.2 PRPS2 表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性采用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫研究PRPS2 mRNA 表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系。結(jié)果顯示：PRPS2 mRNA 表達(dá)水平越高，總體乳腺癌患者的生存期越短（HR=1.28，95%CI：1.15～1.42，P＜0.05）（圖3）。

圖3 PRPS2 mRNA 表達(dá)水平與總體乳腺癌患者生存時(shí)間相關(guān)性Fig.3 Relationship between expression levels of PRPS2 and survival time of breast cancer patients

2.3 PRPS2 在乳腺癌中共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)分析采用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫中的Breast Invasive Carcinoma（TCGA，F(xiàn)irehose Legacy）數(shù)據(jù)集中的1 108 例乳腺癌患者的組織病理學(xué)資料，分析PRPS2 的共表達(dá)基因，排名前25 位基因見表1。

表1 排名前25 位的PRPS2 共表達(dá)基因Tab.1 Top 25 co-expression genes of PRPS2

采用Metascape 軟件對(duì)前25 位基因進(jìn)行GO 和KEGG 分析，結(jié)果表明：PRPS2 的共表達(dá)基因主要與DNA 修復(fù)、對(duì)刺激的反應(yīng)以及與細(xì)胞代謝有關(guān)（圖4）。

圖4 PRPS2 共表達(dá)基因的富集分析和KEGG 分析Fig.4 Enrichment analysis and KEGG analysis of PRPS2 co-expression genes

2.4 靶向PRPS2 3'UTR 的miRNA 分析使用miRTarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)與PRPS2 3'UTR 結(jié)合的hsa-miR-215-5p、hsa-miR-192-5p 和hsa-miR-26b-5p。應(yīng)用UALCAN 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析上述3 種miRNAs 表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與正常組織比較，在泛乳腺癌和不同乳腺癌分子分型中hsa-miR-215-5p 和hsa-miR-26b-5p 表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）（圖5A～5D），與PRPS2 3'UTR 結(jié)合的hsa-miR-215-5p 和hsa-miR-26b-5p 的表達(dá)與PRPS2 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，同時(shí)提示hsa-miR-215-5p 和hsa-miR-26b-5p 很可能影響乳腺癌的預(yù)后。采用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫評(píng)估hsa-miR-215 和hsa-miR-26b 對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響，結(jié)果顯示：hsa-miR-215和hsa-miR-26b 低表達(dá)時(shí)，乳腺癌患者總生存期縮短（圖5E 和5F）。

圖5 與PRPS2 3'UTR 結(jié)合的miRNA 表達(dá)及其與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性Fig.5 Expression of miRNA binding with PRPS2 3'UTR and its relationship with prognosis of breast cancer

3 討論

本研究結(jié)果顯示：①各亞型乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平均明顯高于正常乳腺組織；PRPS2 mRNA 表達(dá)水平越高，乳腺癌患者生存期越短。②PRPS2 3'UTR 結(jié)合的hsa-miR-215-5p 和hsa-miR-26b-5p 在各亞型乳腺癌患者癌組織中表達(dá)水平明顯低于正常乳腺組織，hsa-miR-215-5p 和hsa-miR-26b-5p 表達(dá)水平越低，乳腺癌患者總生存期越短。

在人體內(nèi)PRPS 包括PRPS1、PRPS2 和PRPS3 3 種亞型，分別由PRPS1、PRPS2 和PRPS3 基因編碼，PRPS1 和PRPS2 基因位于X 染色體上，在人體內(nèi)所有組織細(xì)胞中均有表達(dá)，PRPS3 基因定位于7 號(hào)常染色體上，僅在睪丸組織中表達(dá)。PRPS2 是MYC 直接靶點(diǎn)，促進(jìn)核苷酸合成，與癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有密切關(guān)聯(lián)［12］。研究［6，13-16］顯 示：PRPS2 在多種腫瘤中高表達(dá)，如惡性黑色素瘤、胰腺癌、結(jié)直腸癌和惡性淋巴瘤；然而有關(guān)PRPS2 在乳腺癌組織中表達(dá)的研究較少。為了深入研究PRPS2 與乳腺癌的關(guān)系，本研究分別從患者年齡、是否絕經(jīng)、乳腺癌不同分子亞型、不同組織亞型、不同病理分級(jí)和是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等層面進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：PRPS2 mRNA 在上述各乳腺癌研究層面中的表達(dá)均明顯高于正常乳腺組織。本研究中預(yù)后分析結(jié)果表明：PRPS2 mRNA 表達(dá)水平越高，總體乳腺癌患者的生存越差；通過共表達(dá)基因的富集分析，結(jié)果顯示：PRPS2 的共表達(dá)基因主要與DNA 修復(fù)、對(duì)刺激的反應(yīng)以及與細(xì)胞代謝有關(guān)。因此，PRPS2 可能通過調(diào)節(jié)上述相關(guān)信號(hào)通路而發(fā)揮作用。

miRNA 是片段長(zhǎng)度約為22 bp 的非編碼小RNA，與目標(biāo)基因mRNA 3'UTR 結(jié)合，導(dǎo)致目標(biāo)基因mRNA 的降解，進(jìn)而降低目標(biāo)基因編碼蛋白的翻譯［17］。本研究結(jié)果顯示：hsa-miR-215-5p、hsa-miR-192-5p 和hsa-miR-26b-5p 可能與PRPS2 3'UTR 結(jié)合，考慮到具有調(diào)控作用的miRNA 水平與目標(biāo)基因mRNA 水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，hsa-miR-215-5p 和hsa-miR-26b-5p 在泛乳腺癌和不同乳腺癌分子分型中表達(dá)均明顯降低；hsa-miR-215-5p 和hsa-miR-26b-5p 的表達(dá)水平越低，總體乳腺癌患者總生存期越短。WILKE 等［18］發(fā)現(xiàn)：在乳腺癌放射治療后hsa-miR-26b-5p 水平升高；hsa-miR-26b-5p 也參與胰腺癌［19］和肝細(xì)胞癌［20］的發(fā)生發(fā)展。hsa-miR-215-5p 抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲；hsa-miR-215-5p 參與大腸癌［21］、肺腺癌［22］和急性髓性白血病［23］的發(fā)生發(fā)展。

本研究的局限性：①本研究采用共享網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析PRPS2 表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系，并未進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；②由于Kaplan-Meier plotter 網(wǎng)絡(luò)共享數(shù)據(jù)庫更新速度不一，Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫中只收錄hsa-miR-215 和hsa-miR-26b，并未對(duì)這2 種miRNA 的5'端臂和3'端臂加工產(chǎn)物予以區(qū)分；此 外，hsa-miR-215-5p 和hsa-miR-26b-5p 是2 種miRNA 的代表性加工產(chǎn)物。因此本研究預(yù)后分析中只能以hsa-miR-26b 和hsa-miR-215 驗(yàn)證PRPS2表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性。

綜上所述，各亞型乳腺癌患者癌組織中PRPS2 mRNA 表達(dá)水平均明顯高于正常乳腺組織，PRPS2 mRNA 表達(dá)水平越高、PRPS2 3'UTR 結(jié)合的hsa-miR-215-5p 和hsa-miR-26b-5p 表達(dá)水平越低，乳腺癌患者總生存期越短，提示PRPS2 具有泛乳腺癌特征性基因表達(dá)特點(diǎn)，乳腺癌中可能存在miRNA-PRPS2-乳腺癌預(yù)后的調(diào)控軸。