膽道閉鎖患兒肝組織中GPC3 和α-SMA 表達與肝功能指標的相關性分析

吳宙光,王 斌,程 珍,張文杰,左桃燕,陳思琦,付靜茹

（深圳市兒童醫(yī)院普外科，廣東 深圳 518026）

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是一種以進行性膽汁肝硬化為特征的新生兒膽管疾病，可導致膽汁淤積、肝纖維化和肝硬化，最終發(fā)展為晚期肝功能衰竭，病毒感染、毒素刺激和免疫失調參與BA的發(fā)生發(fā)展［1-2］。Kasai 手術治療是其主要治療方式，術后大部分BA 患兒易發(fā)生肝纖維導致肝硬化，需行肝移植治療，因此早期尋找特異性生物標志物預測BA 術后疾病進展的敏感性血清學指標尤為重要。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（phosphatidylinositol proteoglycan 3，GPC3）在調節(jié)肝臟胚胎形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，可作為肝纖維化進程的早期生物標志物和免疫治療靶點［3-4］。α-平滑肌肌動蛋白（alphα-smooth muscle actin，α-SMA）是肝成纖維細胞的標志物，可促進肝纖維化進程，α-SMA 的高表達與肝纖維化程度呈正相關關系［5-7］。目前，關于BA 患兒GPC3 和α-SMA 的表達與肝功能指標及預后相關性的研究較少。因此，本研究探討B(tài)A患兒肝組織中GPC3 和α-SMA 的表達與肝功能指標的相關性，以期為指導BA 患兒術后精準治療及預后判斷提供重要的依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象、主要儀器和試劑選擇廣東省深圳市兒童醫(yī)院普外科2018 年6 月—2019 年12 月就診的BA 患兒26 例，所有患兒均行Kasai 術。選擇同期20 例接受肝活檢且無纖維化的膽總管囊腫患兒為對照組。術后隨訪6 個月（門診或住院隨訪復查）后根據肝功能水平分為預后良好組18 例和預后不良組8 例。納入標準：符合BA 診斷的患兒，資料完整者及配合檢查者，其中BA 患兒肝臟病理活檢符合肝小葉間膽管缺如（膽管數/匯管區(qū)≤2 mm），肝內膽管顯影不清晰，造影劑滲漏。排除標準：資料不完整、不配合檢查、失訪者、膽道發(fā)育不良、膽汁淤積癥和肝臟腫瘤患兒。所有患兒家屬均知情同意并簽署同意書，此項研究通過本院倫理委員會批準。CFX96 熒光定量PCR 儀為美國Bio-Rad 公司產品，GPC3 和α-SMA 蛋白一抗購自美國Merck Millipore 公司。PCR 試劑（2×RealStar Green Power Mixture）購自Genstar 公司。GPC3引物序列為5'-GATACAGCCAAAAGGCAG-3'和5'-ATCATTCCATCACCAGAG-3'，α-SMA引物序列為5'-CTGCTGAGCGTGAGATTGTC-3'和5'-CTCAAGGGAGGATGAGGATG-3'。

1.2 觀察指標和分組收集所有研究對象的社會人口學特征和臨床數據，包括手術時年齡、性別，血清白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、直接膽紅素（direct bilirubin，DB）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和γ-谷氨酰轉氨酶（γ-gamma glutamyl transferase，γ-GGT）水平；根據血清TB和ALT 水平及臨床表現，將患兒分為預后良好組和預后不良組。預后良好組：手術成功后6 個月，大便顏色由淡變?yōu)榈S色，血清TB 水平恢復正常，肝功能滿意（TB＜34.2 μmol·L－1，ALT＜100 IU·L－1）；預后不良：Kasai術后6個月出現膽汁淤積，嚴重肝功能障礙（TB ≥34.2 μmol·L－1，ALT≥100 IU·L－1）。肝纖維化程度采用Metavir 評分，根據肝纖維化程度分為F0～F4組，F0-1組（0～1分）、F2-3 組（2～3分）和F4組（4分），Metavir評分≥2分為顯著肝纖維化，Metavir 評分4 分為肝硬化。

1.3 實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）和免疫組織化學法檢測肝組織中GPC3 和α-SMA mRNA 和蛋白表達水平采用TRIzol 法提取肝組織RNA，逆轉錄為cDNA，行RT-qPCR 法檢測，GAPDH 為內參管家基因，采用2－ΔΔCt法計算肝組織中GPC3 和α-SMA mRNA 表達水平，每個樣本重復3 次。采用免疫組織化學法分析肝組織中GPC3 和α-SMA 蛋白表達，肝組織標本石蠟包埋，組織切片脫蠟后，0.3%過氧化氫抑制內源性過氧化物酶活性10 min，予以10 mmol·L－1檸檬酸緩沖液（pH6.0）抗原恢 復5 min，孵育一抗2 h，隨后用辣根過氧化物酶結合的二抗在室溫下孵育45 min，反應產物用3，3-四鹽酸鹽二氨基聯苯胺染色，并用蘇木精對切片進行復染。細胞核或胞質染成棕色或棕黃色判定為GPC3 和α-SMA 蛋白表達陽性。GPC3 和α-SMA蛋白半定量分析根據陽性細胞百分率評分。0 分：陽性細胞＜1%；1 分：陽性細胞1%～25%；2 分：陽性細胞26%～50%；3 分：陽性細胞51%～74%；4 分：陽性細胞≥75%。GPC3 和α-SMA 的染色強度評分：（－）未染色，（+）弱染色，（?）中度染色，（?）強染色。陽性區(qū)域檢測GPC3 和α-SMA 陽性細胞隨機選擇的5 個視野（×200）。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。2 組患兒年齡、ALB、TB、TB、DB、ALB、ALT、AST、ALP 和γ-GGT 水平均符合正態(tài)分布，以表示，2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗；Metavir 評分及肝組織中GPC3 和α-SMA mRNA 及蛋白表達水平不符合正態(tài)分布，以中位數（四分位數）表示，組間比較采用非參數分析（Mann-WhitneyU檢驗）；計數資料（性別）以例數（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson 相關分析評估GPC3 和α-SMA 表達水平與肝功能指標（ALB、TB、DB、ALT、AST、ALP、γ-GGT 和Metavir 評分）的相關性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般基線資料與對照組比較，BA 組患兒手術年齡更低（P＜0.01），血清中TB、AST、ALP和γ-GGT 水平及Metavir 評分明顯升高（P＜0.05）；2 組患兒性別構成比、ALB 和ALT 水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2 組患兒一般臨床資料Tab.1 General clinical data of children in two groups

2.2 2 組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA mRNA 表達水平及其相關性與對照組比較，BA 組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05）；BA 組患兒肝組織中GPC3 與α-SMA mRNA 表達水平呈正相關關系（r=0.537，P=0.005）。見表2。

表2 2 組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of GPC3 and α-SMA mRNA in liver tissue of patients in two groups [M(P25,P75)]

2.3 2 組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平免疫組織化學法檢測肝組織中GPC3 蛋白表達情況，26 例先天性BA 患兒肝組織標本中，21 例（80.8%）BA 患兒肝組織GPC3 蛋白表達陽性，膽道上皮細胞和肝實質細胞的細胞質中均可檢測到GPC3 蛋白的過表達（圖1A）；與BA 組比較，對照組患兒肝組織中GPC3 蛋白表達不明顯，胞漿染色微弱。根據α-SMA 定位，20 例（76.9%）BA 患兒肝臟中α-SMA 蛋白染色陽性，BA 組患兒肝臟中，α-SMA 蛋白主要表達于門靜脈束周圍的成纖維細胞的細胞質中，主要是膽管和膽管間隙（圖1B），而對照組患兒非BA 肝組織α-SMA 蛋白染色陰性。

圖1 2 組患兒肝組織中GPC3（A)和α-SMA（B）蛋白表達情況（免疫組織化學，×200）Fig.1 Expressions of GPC3(A) and α-SMA(B) proteins in liver tissue of patients in two groups(Immunohistochemistry，×200）

與對照組比較，BA 組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 2 組患兒肝組織中GPC3（A）和α-SMA（B）蛋白表達半定量分析Fig.2 Semi-quantitative analysis of GPC3(A) and α-SMA(B) protein expressions in liver tissue of patients in two groups

2.4 BA 組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平與肝功能指標的相關性Pearson 相關分析結果顯示：GPC3 蛋白表達水平與患兒年齡（r=－0.384，P=0.026）、ALB水平（r=－0.514，P=0.005）和AST 水平（r=－0.327，P=0.035）呈負相關關系，與ALP 水平（r=0.582，P=0.008）和Metavir 評分（r=0.468，P=0.016）呈正相關關系；α-SMA 蛋白表達水平與ALP 水平（r=0.465，P=0.016）和Metavir評分（r=0.422，P=0.010）呈正相關關系。見表3。

表3 BA 組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平與肝功能指標的相關性分析Tab.3 Analysis on correlations of GPC3 and α-SMA protein expression levels in liver tissue with liver function indexes of patients in two groups

2.5 不同預后組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平及肝纖維化程度與預后良好組比較，預后不良組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平及Metavir 評分升高（P＜0.01）。見表4。

表4 不同預后組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平及Metavir 評分Tab.4 Expression levels of GPC3 and α-SMA proteins in liver tissue of and Metavir scores of patients in different prognostic groups [M(P25,P75）]

3 討論

BA 發(fā)病機制不明確，主要與遺傳、病毒感染和免疫調節(jié)等多因素有關，通常采用Kasai 肝門空腸吻合術（KPE）進行手術治療。然而，大部分BA 患者仍因肝纖維化進展為肝硬化需進行肝臟移植治療［8-9］。因此，研究者迫切需要更好地了解BA患兒KPE 術后疾病進展及其與肝功能障礙及纖維化的相關分子標志物，可能有助于改善患兒的臨床結局和推遲肝移植治療的時間［2，8］。目前BA 肝纖維化發(fā)病機制的分子機制尚未完全闡明，參與Wnt/β-catenin 和（或）hedgehog 信號通路的GPC3可作為預測肝癌疾病進展的生物標志物，對肝癌患者的疾病進展及預后具有重要預測價值［4，10］。α-SMA 蛋白表達水平升高促進肝纖維化和肝損傷程度，可作為預測肝硬化甚至肝癌進展的有效指標［7，11］。目前很少有研究探討GPC3 和α-SMA 蛋白與BA 患兒疾病進展的關聯性。因此，本研究通過分析膽道閉鎖患兒GPC3 和α-SMA 蛋白的表達與肝功能指標的相關性，為今后BA 治療提供重要方向。

GPC3 是硫酸肝素蛋白聚糖家族的一員，通過糖基磷脂酰肌醇鍵附著在質膜的外表面，通過結合多種信號通路調控細胞增殖生長、黏附和形態(tài)發(fā)生，如Hedgehog 信號通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成纖維細胞生長因子和Wnt 信號通 路［4，12］。GPC-3在肝細胞癌（hepalic cell carcinoma，HCC）中過表達，通過激活Wnt/β-catenin 信號通路，促進肝細胞形態(tài)學發(fā)生改變，促進肝癌的增殖生長，目前已成為診斷HCC 的敏感性和特異性較高的生物標志物［13-15］。另有研究［12，14，16］顯示：Wnt/β-catenin 信號通路是BA 膽道形態(tài)發(fā)生的主要調控機制之一，提示GPC-3 與Wnt/β-catenin 信號相互作用失調在膽管發(fā)育中發(fā)揮著關鍵作用。因此，GPC3 可以作為預測膽管發(fā)育性疾病的生物標志物。本研究結果表明：與對照組比較，BA 組患兒肝組織中GPC3mRNA 和蛋白表達水平明顯上調，考慮可能是BA患兒存在肝功能障礙和肝纖維化改變，引起GPC3蛋白的高水平表達。

研究［4，11，17］表明：α-SMA 可通過多種機制（刺激生長因子的產生和細胞外基質的重塑）促進多種細胞的生長和增殖，包括肝癌細胞，提示α-SMA 對BA 細胞形態(tài)發(fā)育的調控具有重要作用，另外，α-SMA 在預測肝纖維化進程中可作為敏感的生物標志物，α-SMA 的高表達多提示肝癌患者的預后不良，研究［5，18-19］顯示：肝α-SMA 蛋白表達水平升高可作為BA 患兒梗阻性膽管病變的生物標志物，與肝纖維化分期級別呈正相關關系。細胞質α-SMA 的表達是肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）激活的組織病理學標志物，HSCs 可活化成肌成纖維細胞，α-SMA 的表達可促進大量分泌細胞外基質，促進肝纖維化進程［7，19-20］。在本研究中，與對照組比較，BA 組患兒肝組織中α-SMA mRNA 和蛋白表達明顯上調，提示α-SMA參與了BA 的發(fā)生發(fā)展。今后需對BA 患兒術后α-SMA 生物標志物進行檢測，為判斷預后提供依據，并對肝纖維化病變予以相應干預措施，可延緩疾病進展，縮短肝移植治療時間。

GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平與肝功能指標的相關性研究結果顯示：GPC3 蛋白表達水平與患兒年齡，血清中ALB 和AST 水平呈負相關關系，與ALP 水平和Metavir 評分呈正相關關系，表明GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平的升高與肝損傷和肝纖維化進展相關。本研究BA 患兒預后分析結果顯示：預后不良組患兒肝組織中GPC-3 和α-SMA蛋白表達水平較預后良好組明顯升高，且肝纖維化Metavir 評分明顯升高，提示BA 術后GPC3 和α-SMA 蛋白明顯升高與預后不良相關，證實GPC3和α-SMA 可作為BA 術后早期預測肝纖維化發(fā)生的生物標志物。另外，本研究僅檢測了BA 患兒、對照組及不同預后組BA 患兒GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平，探討了其與肝功能指標的相關性，尚存在不足；今后擬進一步擴大樣本量檢測相關信號通路變化，即Wnt/β -catenin 信號分子（CTNNB、c-Myc 和CCND-1），探討GCP3 的具體分子作用機制；另外，本研究僅檢測了BA 患兒術后6 個月的GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平，今后擬分析不同GPC3 和α-SMA 蛋白表達水平組BA 患兒遠期預后情況。

綜上所述，BA 組患兒肝組織中GPC3 和α-SMA mRNA 及蛋白表達水平明顯升高；BA 組患兒肝組織中GPC3 與α-SMA mRNA 表達水平呈正相關關系，且預后不良組BA 患兒肝組織中GPC3和α-SMA蛋白表達水平升高，而GPC3和α-SMA的高表達與肝功能障礙相關指標（ALP 水平和Metavir 評分）呈正相關關系。本研究結果提示：GPC-3 和α-SMA 可能成為反映BA 患兒肝功能障礙嚴重程度和肝纖維化程度的潛在標志物，為研究BA 的非移植治療策略提供重要的靶向免疫治療方向，以延緩BA 患兒疾病進展。