Tip60 蛋白在子宮內膜腺癌組織中的表達及其臨床意義

文愛平 ,羅 樂 ,孟志偉 ,金景姬 ,周洪貴 ,朱繼紅

（1.川北醫學院附屬醫院婦產科，四川 南充 637000；2.醫學影像四川省重點實驗室，四川 南充 637000；3.西藏軍區總醫院婦產科，西藏 拉薩 850007；4.吉林大學生命科學院 艾滋病國家重點實驗室，吉林 長春 130012；5.吉林大學第一醫院生殖中心，吉林 長春 130021）

子宮內膜癌是發生于子宮內膜的一組上皮惡性腫瘤，為女性三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，其中以子宮內膜腺癌最為常見［1］。近年來國內外研究［2-3］顯示：子宮內膜腺癌發病率和病死率明顯上升，是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，且子宮內膜腺癌的發病機制尚不十分清楚。研究［1］顯示：子宮內膜腺癌的發病可能與雌激素受體（estrogen receptor，ER），孕激素受體（progesterone receplor，PR），高血壓，糖尿病，抑癌基因p53、p16 和E-鈣黏素（E-cadherin）突變、失活和癌基因-人類表皮生長因子受體2（Her2/neu）過度表達有密切關聯。Tip60 是一種經酵母雙雜交篩選得到的低相對分子質量蛋白，又名KAT5 蛋白，是組蛋白（HAT）酶MSYT 超家族成員之一［4］，其廣泛參與DNA 轉錄、DNA 損傷修復以及細胞信號傳導等細胞過程［5］，與腫瘤和炎癥等疾病的發生密切相關。研究［6］顯示：Tip60 蛋白在前列腺癌組織中表達水平的高低與其發生密切相關。但是關于Tip60 蛋白在子宮內膜腺癌患者癌組織中的表達情況及其臨床意義的研究尚未見報道。因此本研究采用免疫組織化學方法檢測子宮內膜腺癌患者癌組織和正常子宮內膜組織中Tip60 蛋白的表達水平，分析其與患者臨床病理特征的相關性，并進一步探討其與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2012 年1 月—2015 年1 月川北醫學院附屬醫院收治的行標準化手術后經病理確診為子宮內膜腺癌患者84 例，患者術前均未接受任何治療（放化療、生物靶向治療和免疫治療等）。患者年齡34～72 歲，平均年齡（54.29±16.21）歲；WHO病理分化程度：G1 組（高分化）35 例，G2 組（中分化）27 例，G3 組（低分化）22 例；FIGO 分期標準（2009 年版）：Ⅰ期39 例，Ⅱ期20 例，Ⅲ-Ⅳ期25 例；36 例對照子宮內膜組織來源于因子宮肌瘤切除子宮后的正常子宮內膜組織。本研究經患者知情同意并經川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準，倫理批號：2012ER（A）066。

1.2 細胞株和主要試劑人子宮內膜癌細胞株ISHIKAWA（高表達ER）和HEC-1A（低表達ER）均購于上海生命科學院細胞庫。兔抗人Tip60單克隆抗體購自英國Abcam 公司，免疫組織化學SP 法試劑盒、DAB 顯色試劑盒和蘇木素均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，高糖DMEM 培養基和胎牛血清均購自美國Gibco 公司，RIPA 細胞裂解液購自杭州四季青公司。

1.3 免疫組織化學SP 法檢測人子宮內膜腺癌組織中Tip60 蛋白表達水平將子宮內膜腺癌患者癌組織蠟塊和正常子宮內膜組織連續切片，厚度約為4 μm，拷片2 h，修復抗原，經過脫蠟水化，采用免疫組織化學SP 法，嚴格按照試劑盒說明書操作。加入稀釋后一抗Tip60 蛋白4 ℃過夜（稀釋比例1∶300），加入二抗37 ℃、1 h，DAB 顯色，蘇木素復染。用PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照，參照說明書提供前列腺癌陽性作為陽性對照。免疫組織化學SP 法是以高倍鏡（×400）下細胞核中出現棕黃色染色作為陽性結果判定（Tip60 蛋白陽性表達位于細胞核）。高倍鏡下隨機選取3～6 個視野，依據陽性細胞百分比和著色強度雙重判定評分，再將兩者乘積作為最終評分進行分析統計。①按細胞著色深淺評分：陰性記為0 分，淺黃色記為1 分，棕黃色記為2 分，棕褐色記為3 分。②陽性細胞率＜30% 為1 分，30%～70% 為2 分，＞70%為3 分。兩項評分乘積≥3 分記為陽性表達，＜3 分為陰性表達。

1.4 細胞培養人子宮內膜癌ISHIKAWA 和HEC-1A 細胞株使用含10%血清的高糖DMEM 培養基，37 ℃、5%CO2、95%相對濕度條件下培養。2～3 d 更換一次培養基，取對數生長期的細胞，采用RIPA 細胞裂解液提取細胞中的蛋白備用。

1.5 Western blotting 法檢測人子宮內膜細胞株中Tip60 蛋白表達水平接種對數生長期的ISHIKAWA 和HEC-1A 細胞于培養皿中，按照RIPA 細胞裂解液說明書提取細胞中的總蛋白，采用考馬斯亮藍法定量細胞總蛋白，取60 μg 總蛋白點樣，采用10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白，電泳1.5 h 后轉移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，以β-actin 作為內參，PBS緩沖液沖洗后加入二抗，37 ℃孵育2 h，電化學發光顯影后采集條帶圖像，采用Image J 軟件對蛋白條帶進行定量分析。實驗重復3 次。

1.6 統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞中Tip60 蛋白表達水平均呈正態分布，以表示，2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗。不同組織中Tip60 蛋白陽性表達率組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 繪制生存曲線，采用Log-rank 檢驗分析Tip60 蛋白表達水平與子宮內膜癌的總生存率的關系。所有均為雙側檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜腺癌患者癌組織和正常子宮內膜組織中Tip60 蛋白陽性表達率顯微鏡下觀察可見Tip60 蛋白在子宮內膜腺癌患者癌組織中的陽性表達定位于細胞核，呈現棕褐色或黃色顆粒。免疫組織化學SP 法檢測結果顯示：84 例子宮內膜腺癌組織標本中有46 例Tip60 蛋白呈陽性表達，陽性表達率為54.76%（46/84），明顯低于正常子宮內膜組織中Tip60 蛋白陽性表達率［83.33%（30/36）］（χ2=8.859，P＜0.05）。見圖1。

圖1 子宮內膜腺癌組織和正常子宮內膜組織中的Tip60蛋白表達情況(免疫組織化學法,×200)Fig.1 Expressions of Tip60 protein in endometrial adenocarcinoma tissue and normal endometrial tissue(Immunohistochemistry,×200)

2.2 子宮內膜腺癌患者癌組織中Tip60 蛋白陽性表達率與臨床病理特征的關系子宮內膜腺癌患者癌組織中Tip60 蛋白陽性表達率與患者的年齡無關（年齡≥50 歲Tip60 蛋白陽性表達率為60.00%，年齡＜50 歲Tip60 蛋白陽性表達率為55.26%）（χ2=1.073，P=0.300）；不同分化程度的癌組織中Tip60 蛋白陽性表達率比較差異有統計學意義（χ2=8.692，P=0.013），兩兩比較不同臨床病理分期子宮內膜癌組陽性表達有統計學意義（χ2=13.481，P=0.001）。見表1。

表1 Tip60 蛋白陽性表達率與子宮內膜腺癌患者臨床病理特征的關系Tab.1 Relationships between positive expression rates of Tip60 protein and clinicopathological features of endometrial adenocarcinoma patients

2.3 Tip60 蛋白表達與子宮內膜癌患者預后的關系84 例子宮內膜腺癌患者的中位隨訪時間為58 個 月，Kaplan-Meier 生存分析及Log-rank 檢驗結果顯示：Tip60 蛋白高表達患者生存率明顯高于Tip60 蛋白低表達患者（χ2=64.391，P=0.002）。見圖2。

圖2 Tip60 蛋白表達與子宮內膜癌患者預后的關系Fig.2 Relationship between expression of Tip60 protein and prognosis of endometrial adenocarcinoma patients

2.4 Western blotting 法檢測人子宮內膜癌細胞中Tip60 蛋白表達水平人子宮內膜癌ISHIKAWA細胞中Tip60 蛋白表達水平明顯高于HEC-1A 細胞（t=6.736，P＜0.05）。見圖3。

圖3 Western blotting 法檢測ISHIKAWA 和HEC-1A細胞中Tip60 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of Tip 60 proteininISHIKAWA and HEC-1A cells detected by Western blotting method

3 討論

子宮內膜癌是女性常見生殖道惡性腫瘤，雖然多數子宮內膜癌患者因早期具有相關癥狀而就診，但由于世界范圍內目前其發病率明顯上升，導致其病死率呈上升趨勢［2-3］。組蛋白乙酰基轉移酶Tip60 蛋白在染色體重塑和轉錄過程中具有重要意義［6］，Tip60 蛋白通過調節轉錄因子E2F 和c-Myc蛋白的活性，從而調控DNA 的轉錄［7-8］；Tip60 蛋白也參與DNA 修復過程，當其作為轉錄域結構蛋白（TRRAP）的一個輔助因子，通過結合受損的雙 鏈DNA 序列，進而維持DNA 的重塑［9］，Tip60蛋白可以通過乙酰化P53 蛋白誘導損傷DNA 的凋亡［10］。目前關于Tip60 蛋白在惡性腫瘤，如黑色素細胞瘤、膀胱癌、食管癌、乳腺癌、膽管癌和卵巢癌組織中低表達的研究均有報道，且與患者的臨床分期、淋巴結轉移及預后呈負相關關系［11-18］。關于子宮內膜腺癌與Tip60 蛋白表達是否具有相關性目前鮮有報道。

雌激素能夠通過作用于ER，調節細胞內鈣離子濃度，從而發揮著不同的生物學功能。在長時間雌激素作用下的子宮內膜癌患者，組織中TRPV1等多種蛋白的表達會有一定的變化。子宮內膜癌細胞株ISHIKAWA 是一種經典的高表達ER 的細胞，而HEC-1A 則是一種與低表達ER 的細胞。子宮內膜癌根據其發病機制，分為2 型，Ⅰ型為激素依賴型，最為常見，多為子宮內膜腺癌，預后較好；而Ⅱ型為非激素依賴型，較為少見，多為漿液性乳頭癌、未分化癌和透明細胞癌等，預后差。本研究采用Western blotting 法分析顯示：高表達ER 的ISHIKAWA 細胞中Tip60 蛋白的表達水平明顯高于低表達ER 的HEC-1A 細胞。Tip60 蛋白在高表達ER 的細胞株（Ⅰ型子宮內膜腺癌）中明顯上調，提示其與患者預后呈正相關關系。

本研究選取84 例子宮內膜腺癌組織，采用免疫組織化學染色SP 法檢測癌組織中Tip60 蛋白的表達，并以正常子宮內膜組織作為對照進行研究，結果顯示：癌組織中Tip60 蛋白表達水平較正常內膜組織下調，兩者呈負相關關系。本研究結果與CHEN等［11］報道的惡性黑色細胞瘤、MCGUIRE等［14］報道的乳腺癌、ZHANG 等［15］報道的膽管癌和羅樂等［18］報道的卵巢癌組織的研究結果相似，說明Tip60 蛋白可能扮演抑癌基因的角色，并參與調控子宮內膜腺癌的發生發展。ZHANG等［15］研究結果表明：Tip60 蛋白在肝膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）的整個過程中抑制生長和轉移。進一步確定PI3K/AKT 通路是Tip60 的主要信號通路，提示Tip60 蛋白通過PT3K-AKT 途徑調控CCA 細胞增殖和轉移，Tip60 蛋白可能參與調控子宮內膜癌的發生及發展。

本實驗研究了Tip60 蛋白與子宮內膜腺癌患者臨床特征關系，結果顯示：Tip60 蛋白表達與子宮內膜腺癌的分化、FIGO 分期（臨床病理分期）及預后具有明顯的相關性，即分化程度愈差、臨床病理分期愈晚的患者組織中，其陽性表達率愈低。本研究采用Kaplan-Meier 生存分析及Log-rank 檢驗Tip60 蛋白與患者預后的關系，結果顯示：Tip60蛋白高表達患者5 年生存率明顯高于Tip60 蛋白低表達患者。本研究結果與有關研究結果［12-14，18］具有相同趨勢。即Tip60 蛋白的表達水平與黑色素瘤、膀胱癌、食管癌、乳腺癌和卵巢癌的腫瘤分化程度、TNM 分期和（或）卵巢癌的FIGO 分期有關，且影響患者的預后。同時Tip60 蛋白表達水平下調患者的預后不佳，提示其在腫瘤發生發展過程中起到了重要的作用。也與本課題組前期關于乙酰基轉移酶-hMOF 蛋白在子宮內膜癌作用的研究結果類似［19］。

綜上所述，本研究結果顯示：Tip60 蛋白在子宮內膜腺癌組織中低表達，且在臨床病理分期越晚及分化程度越差的患者組織中表達越低，Tip60 蛋白的表達水平與子宮內膜癌總生存率呈明顯負相關關系，提示Tip60 蛋白與子宮內膜腺癌的發生、發展及預后有密切關聯，有望為子宮內膜癌發病機制的研究提供新的思路，用以判斷子宮內膜癌的生物學指標和存在潛在可能的靶向治療點，但其具體的調控機制仍不完全清楚，有待進一步在mRNA 水平和信號傳導通路等方面深入研究，同時需要多中心、大數據分析得以進一步完善及驗證。