應用腦脊液分離病原菌短期培養物構建快速檢測流程的研究

李方強，鄭光輝，張艷，張國軍

作者單位：100070 北京，首都醫科大學附屬北京天壇醫院實驗診斷中心/國家藥監局體外診斷試劑質量控制重點實驗室/北京市免疫試劑臨床工程技術研究中心

中樞神經系統感染是一類由于病原微生物侵犯中樞神經系統的實質、被膜以及血管而引起的急慢性炎癥，是院內常見、嚴重的并發癥之一，可導致嚴重的后遺癥，甚至危及患者的生命[1-2]。傳統病原學診斷方法需要將陽性腦脊液培養液轉種到固體培養基上，過夜孵育以得到足夠的單個菌落來進行細菌鑒定和藥敏試驗，但整個過程耗時漫長。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight-mass spectrometer，MALDI-TOF MS）是近些年發展起來的一種細菌鑒定技術，可快速完成細菌鑒定[3]。在此基礎上，研究者們還嘗試了很多將鑒定過程進一步提速的方案，如直接對陽性培養物進行洗滌離心、過濾等，富集蛋白以直接質譜鑒定[4]。但這些方案往往過程較為復雜，或容易產生額外成本。本研究探討了利用腦脊液陽性培養液轉種后的短期培養物，直接質譜鑒定，并開展快速藥敏試驗的方案，與常規質譜鑒定加常規藥敏試驗的結果比較，驗證該方案的可行性，以構建新的檢測流程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集 2018年11月–2019年10月北京天壇醫院腦脊液培養陽性樣本 216 例，培養液經革蘭染色后證實為單一細菌感染，僅保留患者第一次腦脊液培養陽性樣本。質控菌株為大腸埃希菌 ATCC 8739、金黃色葡萄球菌 ATCC 29213、大腸埃希菌 ATCC 25922。

1.1.2 儀器與試劑 Bact/Alert 3D 培養儀、VITEK-MS 質譜分析儀、VITEK-2 Compact60 鑒定藥敏儀、Bact/Alert PF 兒童血培養瓶、基質液CHCA、GN09 藥敏卡、GP67 藥敏卡均購自法國生物梅里埃公司；哥倫比亞血瓊脂平板購自美國賽默飛世爾公司。儀器均經過定期校準，試劑在效期內使用。

1.2 方法

1.2.1 腦脊液培養陽性標本短期培養物鑒定 使用一次性無菌注射器抽取少量陽性培養液（20～50 μl）轉種于哥倫比亞血瓊脂平板上，平板置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。5.5 h 后觀察菌膜形成情況，使用 1 μl 接種環刮取少量菌膜，均勻涂布于靶板靶點上。加 1 μl CHCA 基質液，待自然干燥結晶后上機進行質譜分析。鑒定結果與繼續過夜孵育 24 h 后菌落質譜鑒定結果比較。菌株數據庫使用廠家配套的最新版本 VITEK-MS IVD軟件。如果 MALDI-TOF MS 鑒定兩個時間點均失敗，則通過 16S rRNA 基因序列分析方法鑒定微生物。

1.2.2 短期培養物藥敏試驗 同時刮取孵育 5.5 h后的菌膜，配置 0.5 麥氏濁度菌懸液。根據菌膜質譜鑒定結果，革蘭氏陰性菌選擇 VITEK GN09 藥敏卡、革蘭氏陽性菌選擇 VITEK GP67 藥敏卡，使用 VITEK-2 Compact60 全自動鑒定藥敏儀進行藥敏試驗。其結果與繼續過夜孵育 24 h 后菌落常規藥敏試驗結果比較。藥敏試驗結果使用儀器配套的 CLSI M100-S28 專家規則判讀。對于每種抗菌藥物，兩者結果相同記為一致；若耐藥菌株檢測為敏感，則記為重大差異；若敏感菌株檢測為耐藥，則記為主要差異；若中介菌株檢測為敏感或耐藥、敏感或耐藥菌株檢測為中介，則記為微小差異[5]。按照 CLSI M52 商品化微生物鑒定及藥物敏感性試驗系統指南要求來評估兩種方法的一致性。

2 結果

2.1 短期培養物鑒定結果

本研究共納入 216 例腦脊液培養陽性樣本，其中，革蘭氏陰性菌 81 例，革蘭氏陽性菌 131 例，真菌 4 例。利用短期培養物進行 MALDI-TOF MS鑒定的總體正確率達到 90.7%。其中，常見革蘭氏陰性菌鑒定正確率達到 94.9%，1 株肺炎克雷伯菌、1 株鮑曼不動桿菌、1 株銅綠假單胞菌和 1 株嗜麥芽窄食單胞菌短期培養后未獲得鑒定結果，過夜培養 24 h 后鑒定正確。常見革蘭氏陽性菌鑒定正確率為 89.4%，1 株表皮葡萄球菌短期培養法后錯誤鑒定為溶血葡萄球菌，6 株表皮葡萄球菌、1 株人葡萄球菌、1 株頭狀葡萄球菌、2 株沃氏葡萄球菌、2 株肺炎鏈球菌和 2 株紋帶棒狀桿菌短期培養法后未獲得鑒定結果，具體結果見表 1。

表1 MALDI-TOF MS 鑒定短期培養物結果Table 1 The results of MALDI-TOF MS identification using short-term cultures

2.2 革蘭氏陰性桿菌短期培養物藥敏結果

革蘭氏陰性桿菌利用短期培養物進行藥敏試驗與常規方法藥敏試驗的一致性為 99.7%，微小差異、主要差異、重大差異分別為 0.1%、0.2%、0.0%。其中，產生差異的抗生素有頭孢他啶、左氧氟沙星。革蘭氏陰性桿菌藥敏試驗結果見表 2。

表2 革蘭氏陰性桿菌短期培養藥敏試驗與常規藥敏試驗一致性結果Table 2 The results of short-term culture drug sensitivity test of gram-negative bacilli were consistent with those of routine drug sensitivity test

2.3 革蘭氏陽性球菌短期培養物藥敏結果

革蘭氏陽性球菌利用短期培養物進行藥敏試驗與常規方法藥敏試驗的一致性為 99.4%，微小差異、主要差異、重大差異分別為 0.3%、0.1%、0.3%。其中，產生差異的抗生素有紅霉素、青霉素、氨芐西林、克林霉素以及復方新諾明。革蘭氏陽性球菌藥敏試驗結果見表 3。

表3 革蘭氏陽性球菌短期培養藥敏試驗與常規藥敏試驗一致性結果Table 3 The results of short-term culture drug sensitivity test of gram-positive cocci were consistent with those of routine drug sensitivity test

3 討論

神經外科術后導致的中樞神經系統感染一直是我院臨床抗感染治療中關注的重點問題。患者一旦形成顱內感染，往往病情發展迅速，病死率高[1-2]。傳統病原學診斷方案耗時較長，完成培養、鑒定和藥敏流程，回報臨床結果一般需要 3～5 d 的時間，導致臨床科室使用抗菌藥物治療通常為經驗用藥。而不同的科室其分布的細菌、耐藥性都有差異[6]，使得抗生素的使用也出現偏差，會導致患者住院日延長、醫療費用增加，甚至死亡率上升等不良后果[7]。

MALDI-TOF MS 技術作為一種新興技術，在微生物鑒定領域取得了極大的成績，該技術的應用大大改進并加速了常規微生物學診斷，比傳統生化反應鑒定方法有更好的表現，單個測試的試劑成本也更為低廉[8-10]。在既往的諸多研究中，研究者們還嘗試了通過對陽性培養液進行前處理，如多步洗滌離心、過濾、真空采血管離心、商業化處理試劑盒等多種方案來進一步縮短血液或無菌體液陽性培養物的鑒定時間[11-14]。但是這些方法操作流程相對復雜，涉及多個步驟，或增加額外成本，難以整合到正常試驗流程中去。而本研究所采用的方案將腦脊液陽性培養物在固體培養基上進行非常短暫的培養，形成菌膜，使用質譜技術鑒定，進行快速藥敏試驗，可以較好地整合到實驗診斷流程中，不需要額外的成本消耗、時間花費或特殊經驗，能夠更好地減少培養瓶中活性炭和各類雜蛋白對質譜鑒定的影響，唯一不同的工作步驟是更早地觀察轉種后的瓊脂平板，到達短期培養時間點后即可開始日常 MALDI-TOF MS 操作程序、藥敏試驗操作步驟。可以在質譜技術縮短細菌鑒定時間的基礎上進一步壓縮檢測周轉時間，將微生物鑒定報告的周期縮短 18～42 h。

根據國內外相關研究報道[15-17]，以及本研究前期預實驗結果，我們綜合考慮了轉種后革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌形成可鑒定菌膜的時間，以及構建快速鑒定藥敏流程的易操作性，最終選定了 5.5 h這一個短期培養時間點。本研究中，腦脊液陽性樣本利用短期培養質譜鑒定與過夜培養質譜鑒定的符合率可達到 90.7%，其中常見革蘭氏陰性菌更高達 94.9%。同時，我們發現革蘭氏陽性菌的鑒定符合率要低于陰性菌，與李媛睿等[18]的報道基本一致，可能由于鏈球菌屬、棒狀桿菌屬細菌生長相對緩慢，不能獲得足量的蛋白信號進行分析，可以根據革蘭染色鏡下形態協助提前判斷，適當延長培養時間以得到足夠菌膜。另外，提前采用 0.5 μl 甲酸處理菌落，可更好地破壞陽性菌胞壁，充分暴露出核糖蛋白，增加鑒定成功率。

為了解決常規藥敏試驗耗時長、報告慢、指導臨床用藥不及時的問題，本研究還對腦脊液培養中的常見菌進行了短期培養物 MIC 法藥敏試驗。與常規藥敏試驗方法相比，革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌藥敏結果一致性為 99.7%、99.4%，報告時間可縮短 24 h。其中革蘭氏陰性菌結果與其他類似研究相比，表現為本研究一致性較高[19]。我們分析原因為本院術后顱內感染的患者往往病情較重，多為ICU 病房患者，發生院內感染的概率很高。本研究納入病例分離到的革蘭氏陰性菌多為泛耐藥的肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌，占比達到 72.7%，藥敏試驗多數抗生素均為耐藥，導致兩種方法結果無各類差異。這也是本研究的不足之處，結果不夠全面，日后應進一步擴大樣本量和菌種多樣性。

綜上所述，本研究探討了從含有活性炭成分培養瓶中得到腦脊液陽性培養物，轉種至固體培養基上短期培養，進行質譜鑒定和快速藥敏的可行性很高。兩者的結合能夠使微生物室工作流程進一步優化，顯著縮短檢測周轉時間，有助于臨床更快速、準確地獲得病原學證據，改善患者預后、降低醫療費用，對減少耐藥菌有積極的意義，產生重要的臨床應用價值[20]。