嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌H002對鈾的生物吸附

陳天宇， 孫 敏， 馮 紅

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610065)

1 引 言

鈾的原子序數(shù)為92，元素符號為U，相對原子質(zhì)量238.03 Dalton，屬錒系金屬，是在自然界中能找到的最重的金屬物質(zhì)[1].鈾的天然同位素有三種，分別是U235、U234和U238且都具有放射性，三者中豐度最高的U238為99.28%，最低的U234為0.006%.這三種同位素都有極長的半衰期，分別為(U238) 4.51×109、(U235)7.09×108和(U234) 2.35×105年[2].

鈾作為一種重要的核燃料，是核工業(yè)不可缺少的重要資源，但是鈾也是一種具有強(qiáng)烈化學(xué)毒性和放射性的元素，其污染對自然環(huán)境和生物可能帶來較大的危害.近年來，隨著核工業(yè)的發(fā)展，對鈾的需求越來越多，可溶性鈾帶來的原位污染及其容易進(jìn)入其他環(huán)境的遷移性[3]，已成為人類所面臨的重大環(huán)境挑戰(zhàn).現(xiàn)有的鈾污染治理方法可分為物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)，物理修復(fù)法主要依靠土壤封埋來處理污染物，而化學(xué)修復(fù)法則主要是通過化學(xué)物質(zhì)淋洗的方式來處理鈾污染[4-5].但無論是化學(xué)修復(fù)法還是物理修復(fù)法，都因其成本、有效程度、易造成二次污染等原因存在著局限.因此，為了更好的實(shí)現(xiàn)對鈾污染的控制，生物修復(fù)的方法逐漸開始進(jìn)入人們的視線.

在鈾污染的治理材料中，微生物擁有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，微生物生長迅速，幾小時(shí)即可繁殖一代，且不具化學(xué)毒性不會對環(huán)境造成二次污染.有報(bào)道稱微生物中藻類、細(xì)菌、真菌和酵母都可以對金屬元素進(jìn)行吸附，可以發(fā)展成為一種環(huán)保、高效的鈾污染治理材料[6-8].微生物細(xì)胞的表面吸附通常是指作為陽離子的鈾酰離子與細(xì)胞表面的陰離子配體結(jié)合，該過程主要涉及靜電吸附與表面絡(luò)合.部分微生物可以通過代謝活動在自身的細(xì)胞壁外產(chǎn)生名為胞外聚合物(EPS)的大分子物質(zhì)，EPS主要由多糖，蛋白質(zhì)，腐殖質(zhì)，糖醛酸，核酸和脂質(zhì)組成，并且含有羧基、磷酸基團(tuán)等官能團(tuán)[9-11].它可以作為細(xì)胞抵御惡劣外部環(huán)境的屏障，也能為鰲合鈾離子提供潛在的結(jié)合位點(diǎn).除了EPS之外，細(xì)胞表面自身還含有豐富的官能團(tuán)，這也有助于對鈾元素的吸附.本研究通過對142株具有輻射抗性的細(xì)菌分離物進(jìn)行篩選，得到了一株好氧的、具有較高輻射抗性并能夠高效吸附可溶性鈾的嗜麥芽糖寡氧單胞菌H002，并分析了其與鈾的相互作用，為發(fā)展鈾污染的生物治理提供幫助.

2 材料和方法

2.1 材 料

2.1.1 菌 種 嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia) H002菌株由本實(shí)驗(yàn)室從60Co輻照場中分離所得，并保存.

2.1.2 試劑及培養(yǎng)基 TGY培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨5 g，酵母粉3 g，葡萄糖1 g.

偶氮胂Ⅲ溶液(0.1% w/v):將100 mg的偶氮胂Ⅲ [2,7-雙(2-苯胂酸-1-偶氮)變色酸]試劑溶解在100 mL的10%乙醇中.

標(biāo)準(zhǔn)鈾溶液(1 g/L)：1.78 g乙酸鈾酰加水溶解后定容至1 000 mL.

其它試劑：乙酸鈾酰購于奧克公司；Trizol試劑購于Invitrogen；溶菌酶購于上海懋康生物科技有限公司；DNase Ⅰ 購于大連寶生物；Taq DNA 聚合酶購于南京諾唯贊.

2.2 方 法

2.2.1 耐鈾細(xì)菌分離物的篩選 將活化后的142株細(xì)菌分離物按1%的接種量接種到1 mL至于96孔深孔板的含鈾TGY培養(yǎng)基中，并設(shè)置不加鈾的空白對照，每隔12 h取100 μL菌液用酶標(biāo)儀測定其600 nm波長處的光密度值，以此繪制0～72 h的細(xì)菌分離物生長曲線，通過比較生長情況篩選耐受鈾的細(xì)菌分離物.

2.2.2 H002分離物16S rRNA擴(kuò)增及比對 使用細(xì)菌16s rRNA的保守引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′; 1492R: 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，挑取少許菌落細(xì)胞，采用PCR擴(kuò)增H002分離物的16 s rRNA基因.反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min.將PCR產(chǎn)物送擎科生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序，并與Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫[12]進(jìn)行比對.

2.2.3S.maltophilia生長曲線的測定 在50 mL TGY培養(yǎng)基中接入0.5 mL過夜活化的菌液，將培養(yǎng)基置于200 r/min的搖床中30 ℃培養(yǎng)，每隔12 h取1 mL菌液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后用酶標(biāo)儀測定600 nm波長處的光密度值，以此表示細(xì)胞密度.然后將培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞密度作圖，繪制細(xì)菌細(xì)胞的生長曲線.

2.2.4 偶氮胂Ⅲ法測定鈾離子濃度 取鈾標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 g/L)，分別稀釋至10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L，按照1∶1∶1依次加入0.5 N鹽酸、偶氮胂Ⅲ試劑.室溫顯色3 min，用酶標(biāo)儀測量652 nm的光密度值，根據(jù)其OD652的數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.2.5 H002細(xì)胞吸附鈾的分析測定 將活化后的S.maltophilia按照1%的接種量接入TGY液體培養(yǎng)基中30 ℃，200 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，然后在4 ℃、5 000 r/min離心15 min收集菌體，并用滅菌的1 mmol/L的NaCl溶液洗滌三次，將細(xì)胞重新懸浮于水，調(diào)整細(xì)胞濃度到相當(dāng)于2 g/L干重(測定細(xì)胞含水量約為90%).

然后，在細(xì)胞懸液中加入終濃度分別為200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L的U(VI)溶液.將菌、鈾混合物置于30℃，200 r/min條件下吸附24 h.在此期間，定點(diǎn)取樣，10 000 r/min離心2 min去除細(xì)菌細(xì)胞，取上清按照1∶1∶1的比例依次加入0.5 N鹽酸、偶氮胂Ⅲ試劑.室溫顯色3 min，用酶標(biāo)儀測量652 nm的光密度值，根據(jù)其OD652的數(shù)值，按照2.2.4所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鈾含量.同時(shí)設(shè)置不加細(xì)胞的對照.按照下列公式計(jì)算鈾的去除率.

鈾的去除率= (對照中鈾濃度-樣品殘留鈾濃度)/對照鈾濃度 × 100%

2.2.6 細(xì)胞不同生長狀態(tài)對鈾吸附的影響 將在TGY中活化后的S.maltophilia細(xì)胞，按照1%的接種量接入TGY液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)8 h、12 h和24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)離心收集菌體(4℃，5 000 r/min離心15 min)，用滅菌的1 mmol/L NaCl溶液洗滌三次洗去殘存培養(yǎng)基.然后配制500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)鈾溶液，分別與相當(dāng)于干重1 g/L的細(xì)菌細(xì)胞混合.最后將反應(yīng)體系放在30 ℃，200 r/min的條件下作用4 h后測定上清中的鈾含量.

2.2.7 共存離子對鈾吸附的影響 配制標(biāo)準(zhǔn)鈾濃度300 mg/L，分別加入終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的K+、Na+、Mg2+、Mn2+陽離子和CO32-、SO42+、HCO3-陰離子，然后與H002細(xì)胞(相當(dāng)于1 g/L的干重)混合，30 ℃， 200 r/min 反應(yīng)14 h.最后，取樣測定上清中殘余的鈾含量.

2.2.8 不同表面活性劑對鈾吸附的影響 使用鈾濃度為300 mg/L的鈾(Ⅵ)溶液分別配置0.1%和0.5%的SDS、Triton-X100、Tween-80溶液，將S.maltophilia按照1 g/L的干重加入到上述溶液中30 ℃，200 r/min作用14 h，取樣測定殘余鈾濃度.

2.2.9 羧基酯化反應(yīng) 將5.4 mL濃鹽酸和10 mL無水乙醇混合均勻，與相當(dāng)于干重為0.1 g的S.maltophilia細(xì)菌混合，放置于37 ℃搖床中，200 r/min反應(yīng)4 h，再用滅菌的超純水反復(fù)洗滌三次，離心收集細(xì)胞沉淀，再用250 mg/L的U(Ⅵ)溶液重新懸浮，置于37 ℃，200 r/min反應(yīng)24 h，最后取樣，測定上清中殘留的鈾濃度.

2.2.10 氨基乙酰化反應(yīng) 將乙醇和乙酸酐按照10∶1的比例混合，取10 mL混合液加入到相當(dāng)于干重0.1 g的S.maltophilia的細(xì)菌中，混合均勻，置于37 ℃搖床中，200 r/min反應(yīng)4 h，用滅菌的超純水反復(fù)洗滌三次，離心沉淀細(xì)胞，然后與250 mg/L的U (Ⅵ)混合均勻，于37 ℃，200 r/min反應(yīng)24 h，然后取樣測定上清中的鈾濃度.

2.2.11 X射線光電子能譜分析(XPS) 離心收集吸附鈾以后的S.maltophilia細(xì)胞(吸附條件：300 mg/L鈾濃度，1 g/L菌量，12 h培養(yǎng)的細(xì)胞)，用超純水洗滌三次，經(jīng)-80 ℃預(yù)凍，-58 ℃抽真空(真空度0.180 mbar)主凍48 h，獲得凍干細(xì)胞樣品，然后使用XSAM800 X射線光電子能譜儀分析.

3 結(jié) 果

3.1 耐鈾嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌H002的篩選與鑒定

本實(shí)驗(yàn)室從60Co輻照環(huán)境中分離獲得了142株具有不同輻射抗性的細(xì)菌分離物.為了探討這些抗性細(xì)菌在治理放射性重金屬離子中的應(yīng)用潛力，對這142株細(xì)菌分離物耐受重金屬鈾的能力進(jìn)行了篩選.在接種有細(xì)菌分離物的TGY培養(yǎng)基中，分別加入終濃度為80和150 mg/L的六價(jià)金屬鈾[U(VI)]，進(jìn)行了兩輪篩選，發(fā)現(xiàn)只有細(xì)菌分離物H002能夠在不同程度上，耐受測試的2個(gè)鈾濃度.圖1顯示在80 mg/L的U(Ⅵ)脅迫條件下，細(xì)菌分離物H002細(xì)胞的生長動態(tài)，從中可以看出，在此濃度的鈾并未抑制H002細(xì)胞的生長.因此，認(rèn)為H002具有耐受U(Ⅵ)的能力.

圖1 H002分離物在80 mg/L鈾脅迫下的生長曲線Fig.1 Growth curves of bacteria isolate H002 under uranium stress (80 mg/L)

為了確定篩選到的細(xì)菌分離物H002的屬種，方便后續(xù)研究，本研究通過測定H002的生理生化特性和16S rRNA序列對H002進(jìn)行了鑒定.利用細(xì)菌16S rRNA保守引物，通過PCR技術(shù)，擴(kuò)增出H002全長的16S rRNA序列，并與Ezbiocloud[12]數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對.結(jié)果如圖2所示，H002的16S rRNA與嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)聚類在一起，其序列與S.maltophilia MTCC434 (type)的16S rRNA相似度高達(dá)99%以上.因此，根據(jù)16S rRNA序列初步判斷H002的分類學(xué)地位應(yīng)屬于嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia).

圖2 H002分離物16S rRNA基因序列比對

3.2 S.maltophilia H002細(xì)胞對U(Ⅵ)的吸附作用及影響因素

生物吸附是從液相中去除重金屬離子的一種重要手段，與其它治理重金屬污染的方式相比，更為綠色環(huán)保，具有一定的應(yīng)用前景.為了探討S.maltophiliaH002在去除重金屬離子污染方面的可能性，首先在1.0 g/L干重的初始細(xì)胞懸液中，分別加入終濃度200和600 mg/L的U(Ⅵ)，在30 ℃，200 r/min振蕩條件下，測定了細(xì)胞對鈾的吸附動態(tài)(圖3a).在初始的1 h以內(nèi)，細(xì)胞吸附鈾的速率快速增加，隨著緩慢降低，4 h后基本達(dá)到平衡.截至8 h，在鈾的初始濃度為200 mg/L條件下，1 g/L干重的H002細(xì)胞能夠基本上去除所有的U(Ⅵ)，去除率約為80%；在600 mg/L的鈾溶液下，去除率約30%.隨后，進(jìn)一步分析了H002不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞對吸附鈾的影響(圖3b)，不同生長狀態(tài)的細(xì)胞在1 g/L干重菌量和300 mg/L初始鈾濃度的條件下，對U(Ⅵ)的吸附能力存在很大的差異.培養(yǎng)12 h的細(xì)胞，其生物吸附量比培養(yǎng)8 h細(xì)胞的吸附量高了將近2.5倍，比24 h提高約1.5倍.由此可見，在利用微生物細(xì)胞吸附去除重金屬時(shí)，應(yīng)考慮細(xì)胞生長特性.

考慮到現(xiàn)實(shí)中的重金屬污染環(huán)境有許多干擾微生物吸附鈾的因素，比如外部現(xiàn)實(shí)環(huán)境中，大多會存在各種陰、陽離子等其它物質(zhì).因此，分析了幾種常見的陰陽離子和表面活性劑對鈾生物吸附的影響，結(jié)果見圖3c.在低濃度下，各種供試的陰、陽離子對H002吸附鈾具有一定的的促進(jìn)作用；但是在高濃度CO32-和HCO31-的條件下，H002細(xì)胞對鈾的吸附量顯著下降，這可能是因?yàn)镃O32-易與UO22+形成絡(luò)合.此外，在供試的三種表面活性劑中，SDS對H002細(xì)胞吸附鈾具有明顯的促進(jìn)作用，無論是在高濃度(0.5%)還是低濃度(0.1%)下，H002細(xì)胞的鈾吸附量均較對照提高了近1倍；但Triton和Tween對H002的吸附影響不大，在低濃度下略有一定的促進(jìn)作用.

圖3 H002對U(Ⅵ)的吸附能力和影響生物吸附的因素(a)H002在不同濃度U(Ⅵ)中的吸附能力, (b)不同生長狀態(tài)對U(Ⅵ)生物吸附的影響，(c)共存離子和表面活性劑對U(Ⅵ)吸附的影響 Fig.3 The biosorption capacity of H002 and the factors affecting the adsorption(a) Adsorption of S.maltophilia H002 on U (Ⅵ) with different concentrations， (b) the influence of different growing status on U(Ⅵ) biosorption， (c) the influence of coexisting ions and surfactant on U(Ⅵ) adsorption

3.3 S.maltophilia H002細(xì)胞與U(Ⅵ)作用的官能團(tuán)

細(xì)菌表面有具有豐富的各種帶電官能團(tuán)，比如氨基和羧基.這些官能團(tuán)可能涉及H002細(xì)胞對鈾的吸附.為此，通過酯化反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)分別屏蔽H002細(xì)胞表面的氨基和羧基，然后加入鈾，分析了這兩種基團(tuán)對鈾吸附的影響.結(jié)果如圖4a所示，在250 mg/L U(Ⅵ)濃度和同樣的菌量(1 g/L)條件下吸附24 h，屏蔽羧基的H002細(xì)胞對鈾的吸附與對照組相比，其去除率急劇下降；但是屏蔽氨基后，并不影響對鈾的吸附，其去除率相差無幾.這說明羧基在H002菌株對U (Ⅵ)的生物吸附中發(fā)揮了非常重要的作用，而氨基的作用可能很小.

圖4 細(xì)胞表面官能團(tuán)對六價(jià)鈾吸附的影響(a)和XPS能譜分析(b)Control：未處理細(xì)胞；NH-A：氨基乙酰化后的細(xì)胞；CH-E：羧基酯化后的細(xì)胞Fig.4 Effect of functional gruops of cell surface on U(Ⅵ) adsorption (a) and XPS spectra analysis (b)Control: cells without treated; NH-A; cells after amino acetylation; CH-E: cells with carboxylic esterification

3.4 S.maltophilia H002與U(Ⅵ)作用的能譜分析

X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy XPS)利用X射線輻射樣品，使樣品原子或分子的內(nèi)層電子受激發(fā)射出來，通過測定這些受激發(fā)的光電子的能量，并結(jié)合脈沖強(qiáng)度即可得到光子能譜圖，通過對光電子能譜圖的分析就可以了解到樣品的化學(xué)組成及化學(xué)狀態(tài)的變化.本研究采用XPS分析了與鈾作用后的H002細(xì)胞以及未吸附鈾的H002細(xì)胞.結(jié)果如圖4b顯示，在吸附鈾的細(xì)胞樣品中，光電子能譜顯示了在U 4f5/2和U 4f7/2兩個(gè)軌道都出現(xiàn)了代表UO22+的特征峰，其結(jié)合能分別為392.70 eV和381.95 eV；相反，未進(jìn)行鈾處理的細(xì)胞樣品中沒有出現(xiàn)明顯的能譜峰.這些結(jié)果證明S.maltophiliaH002細(xì)胞確實(shí)吸附了金屬鈾.

4 討 論

在放射性廢物中，鈾元素因其容易遷移以及能造成長期污染的特性，一直被視為最主要和嚴(yán)重的污染物之一.微生物治理重金屬污染作為一種新興的治理方式，具有更綠色環(huán)保的特點(diǎn).研究微生物與鈾相互作用的機(jī)制，將有助于管理者制定合理的放射性廢物處理策略，以及針對被損害環(huán)境的補(bǔ)救措施.

本實(shí)驗(yàn)室從60Co輻照場分離獲得一批抗輻射的細(xì)菌分離物，經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)一個(gè)分離物H002具有一定的耐受鈾的能力，經(jīng)生理生化和分子鑒定為S.maltophilia.嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)是一種革蘭氏陰性、好氧的細(xì)菌.菌體呈桿狀，極生鞭毛，大小0.7～1.8 × 0.4～0.7 μm， 略小于同屬的其他成員.嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌廣泛存在于自然界的水體、土壤或者植物體中，在人的腸道和呼吸道中也有發(fā)現(xiàn)[13].該菌作為一種條件致病菌，能感染免疫功能不全的人群，可造成嚴(yán)重的呼吸道和尿路感染，并且具有很強(qiáng)的耐藥性，是一種臨床治療難度極大的醫(yī)源感染病原菌[14].目前嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌主要作為病原微生物.研究其致病性、傳染性、耐藥性和一些流行病學(xué)特征，而涉及其他方面的研究較少.根據(jù)報(bào)道，嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌具有耐受并吸附Cd，Pb，Co，Zn，Hg，Ag，鈾酰等重金屬污染的能力[15]，有潛力治理重金屬鈾污染.

因此，本實(shí)驗(yàn)將S.maltophiliaH002作為研究材料，著重分析研究了H002分離物對可溶性六價(jià)鈾的吸附，以及共存離子、表面活性劑、細(xì)菌生長狀態(tài)等對鈾吸附的影響，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面羧基是吸附鈾的主要官能團(tuán).Ca2+、Mg2+和CO32-會通過與鈾結(jié)合的方式來影響對微生物對鈾的去除[16-17]，本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中CO32-和HCO31-的存在會影響H002對鈾的去除能力，但其他的共存離子(包括Mg2+)不影響H002的去除能力.這可能是因?yàn)镠002并不是通過生物還原的機(jī)制去除鈾，而Ca2+、Mg2+等多是影響生物還原來降低鈾的去除率.十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種常見的陰離子表面活性劑，本研究發(fā)現(xiàn)，SDS的加入能顯著地促進(jìn)S.maltophiliaH002細(xì)胞對U(Ⅵ)的吸附，無論在低濃度(0.1%)還是在高濃度(0.5%)條件下，均可以將S.maltophiliaH002細(xì)胞對U(Ⅵ)的吸附能力提高一倍以上.有研究表明，部分表面活性劑能夠極大地改變S.maltophilia細(xì)胞表面的脂肪酸組成，增加其中的支鏈酸的含量[18].支鏈酸的增加也許可能提高表面羥基的數(shù)量，從而促進(jìn)H002細(xì)胞對鈾的吸附.

微生物表面的官能團(tuán)能影響自身對鈾的積累，其中很可能涉及到離子交換的過程[8]，直接對細(xì)胞表面官能團(tuán)的屏蔽實(shí)驗(yàn)也表明，氨基、羧基、磷酸基團(tuán)在微生物對U(Ⅵ)的吸附過程中發(fā)揮著重要作用.通過電位滴定分析可知氨基和羧基都是U(Ⅵ)的主要結(jié)合位點(diǎn)[19]，并且有研究發(fā)現(xiàn)在黑曲霉Aspergillusniger中屏蔽氨基和羧基會顯著的影響它對U(Ⅵ)的吸附[20].在本研究中屏蔽S.maltophiliaH002細(xì)胞表面的羧基導(dǎo)致鈾吸附下降80%，但屏蔽氨基并沒有影響細(xì)胞對U(Ⅵ)的吸附.這說明在S.maltophiliaH002的細(xì)胞表面的羧基官能團(tuán)參與鈾的吸附，但氨基則可能與鈾的互作無關(guān).

5 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從142株具有輻射抗性的細(xì)菌分離物中篩選獲得了一株能夠穩(wěn)定耐受高濃度鈾的嗜麥芽糖寡氧單胞菌(S.maltophilia) H002菌株，其具有輻射抗性的特點(diǎn)能使其能在具有放射性的實(shí)際污染環(huán)境中更好的發(fā)揮生物吸附作用.本實(shí)驗(yàn)分析研究了H002菌株對可溶性六價(jià)鈾的吸附及影響的因素，發(fā)現(xiàn)在TGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h的H002細(xì)胞對鈾具有最強(qiáng)的吸附能力；而且細(xì)胞表面的羧基在鈾的吸附中扮演重要作用.這些分析與實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究微生物對重金屬的耐受機(jī)理提供了線索，也為發(fā)展利用微生物治理鈾污染提供了一定的依據(jù).