不同海拔區域內牦牛腸道菌群結構組成多樣性研究

王保寧， 陳昱作， 貢 嘎， 羅潤波， 周賽賽， 李天嬌， 索朗斯珠

(1.四川大學華西基礎醫學與法醫學院， 成都 610041；2.西藏農牧學院， 林芝 860000)

1 引 言

牦牛(Yak，Bosgrunniens)是高寒地區的特有牛種，草食性反芻動物，也是我國的主要牛種之一，其大多數集中于青藏高原中心地帶及東部邊緣的青海、甘肅和四川西北部[1]. 不同地區的牦牛分布的海拔存在較大的差異[2]. 牦牛是高寒牧區畜牧業中最重要的畜種之一[3]. 由于高海拔地區低溫高寒、草木結構單一、季節不平衡，寒冷季節飼草飼料儲備缺乏等原因，牦牛常常表現出營養不良，體重出現負增長[4]. 近年來，高海拔牦牛向低海拔遷徙，在低海拔地區建設圈舍，采用舍飼培育牦牛，正成為發展牦牛產業的一個創新措施[5]. 本文采用宏基因組測定分析技術對不同海拔地區的牦牛腸道菌群組成結構進行比較研究，初步探索了高低不同海拔區域內的牦牛腸道菌群結構組成，為高低不同海拔區域內的牦牛遷徙和飼喂提供了腸道微生態研究基礎.

2 材料與方法

2.1 樣本采集

隨機采集西部不同海拔區域的12頭成年牦牛的新鮮糞便，其中海拔3 000 m以下地區歸為低海拔組(LA)，平均海拔2942.5，樣本4例，海拔4 000 m以上地區歸為高海拔組(HA)，平均海拔4 372.5，樣本8例. 取樣后立即存于液氮中. 樣本信息見表1.

表1 樣本來源

2.2 方 法

2.2.1 樣品處理與DNA提取 將待測樣本中加入1 mL 65 ℃預熱的CTAB提取液，震蕩混勻，常規乙醇法提取DNA，加入50～100 μL含10 mg/mL RNase的無菌ddH2O，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱.

2.2.2 16s rDNA擴增與擴增產物回收純化 采用細菌16s rDNA V3+V4區域通用引物[6]：上游338F： 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，25 μL體系：模板50 ng，上下游引物各2.5 μL，Pusion Hot start flex 2×Master Mix 12.5 μL. 擴增條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 延伸10 min，于4 ℃保存. PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行回收，回收采用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收.

2.2.3 擴增產物定量混樣上機測序及物種分析 對純化后的PCR產物采用Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統上對文庫進行定量，合格的文庫濃度應在2 nmol/L以上. 將合格的各上機測序文庫(Index序列不可重復)梯度稀釋后，根據所需測序量按相應比例混合，并經NaOH變性為單鏈進行上機測序；使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序，相應試劑為MiSeq Reagent Kit V3 (600 cycles). 將獲得的序列在NCBI BLAST 數據庫中比對后獲得物種信息.

2.2.4 數據分析 基于操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTU)的統計結果，計算樣品的alpha多樣性，用來分析物種變化趨勢. 根據物種特異基因豐度表和物種注釋表，從門、綱、目、科、屬、種水平，對相對OTU豐度進行聚類分析，用t檢驗對高低海拔組間相對豐度的進行差異分析.

3 結 果

3.1 高低不同海拔牦牛腸道菌群結構總體差異

分析測序12個樣本的OTU，高低海拔OTU共有5 322個，其中高海拔4 237個，低海拔4 824個，高低海拔共有的為3 739個，高海拔牦牛特有的腸道菌群為498個，低海拔牦牛特有的微生物為1 085個，低海拔牦牛腸道菌群比高海拔牦牛腸道菌群種類高出587個.

3.2 不同分類水平對高低不同海拔牦牛腸道菌群結構成分分析

3.2.1 門水平腸道菌群結構成分分析 牦牛糞便樣本中共有19個門的細菌. 從門水平對腸道菌群種12個樣本的OTU豐度進行物種聚類統計分析顯示，低海拔牦牛前三的菌群以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)，為主，其平均豐度分別為69.38%、15.37%和7.74%；高海拔牦牛以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，其平均豐度分別為73.21%、14.56%和4.06%.

3.2.2 綱水平腸道菌群結構成分分析 牦牛糞便樣本中共有21個綱的細菌，如圖1. 從綱水平對12個樣本的OUT豐度進行物種聚類統計分析顯示，低海拔牦牛糞便樣本中前三菌群為梭菌綱(Clostridia)擬桿菌綱(Bacteroidia)和以及變形菌綱(Gammaproteobacteria)，其平均豐度分別為64.17%、14.36%和6.12%；高海拔樣本中前三菌群為梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和桿菌綱(Bacilli)，其平均豐度分別為13.46%、62.04%和8.12%.

圖1 牦牛腸道菌群在綱水平的分布圖(A)及分布熱度圖(B)Fig.1 The community structure map (A) and the community structure heatmap(B) of samples at the class level in intestinal tract of yaks

3.2.3 目水平腸道菌群結構成分分析 牦牛糞便樣本中共有21個目的細菌，如圖2. 從目水平對不同海拔牦牛腸道菌群種12個樣本的OTU進行物種分類統計分析顯示，低海拔牦牛糞便樣本中前三菌群分別為梭菌目(Clostridiales)、擬桿菌目(Bacteroidales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)，其平均豐度分別為14.36%，平均豐度64.16%和5.72%；高海拔前三菌群分別為梭菌目(Clostridiales)擬桿菌目(Bacteroidales)和芽孢桿菌目(Bacillales)，其平均豐度分別為62.02%、13.46%和8.02%.

圖2 牦牛腸道菌群在目水平的分布(A)及分布熱度圖(B)Fig.2 The community structure map (A)and the community structure heatmap (B) of samples at the order level in intestinal tract of yaks

3.2.4 科水平腸道菌群結構成分分析 牦牛糞便樣本中共有21個科的細菌，如圖3. 從科水平對不同海拔牦牛腸道菌群種12個樣本的OTU進行物種聚類統計分析顯示，低海拔樣本中前三的菌群分別為瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和梭菌科(Clostridiaceae)，其平均豐度分別為36.35%， 12.59%和 6.43%；高海拔牦牛糞便樣本中前三的菌群分別為瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和活動性球菌科(Planococcaceae)，其平均豐度分別為29.04%、15.14%和6.64%.

圖3 牦牛腸道菌群在科水平的分布(A)及分布的熱度圖(B)Fig.3 The community structure map (A) and the community structure heatmap(B) of samples at the family level in intestinal tract of yaks

3.2.5 屬水平腸道菌群結構成分分析 牦牛糞便樣本中共有21個屬的細菌，如圖4. 從屬水平進行物種聚類統計分析顯示，低海拔牦牛樣本中前三的菌群分別為瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_unclassified)、梭菌屬(Clostridium)和不動桿菌屬(Acinetobacter)，其平均豐度分別為24.45%、6.30%和5.60%；高海拔樣本中前三的菌群分別為瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_unclassified)、活動性球菌屬(Planococcaceae_unclassified)和理研菌屬(Rikenella)，其平均豐度分別為20.27%、6.25%和5.53%.

圖4 牦牛腸道菌群在屬水平的分布(A)及分布的熱度圖(B)Fig.4 The community structure map (A)and the community structure heatmap (B) of samples at the genus level in intestinal tract of yaks

從屬水平對高低海拔牦牛樣本的OTU豐度分析顯示，低海拔牦牛腸道菌群前30菌群豐度總量為83.41%，而高海拔同類菌群豐度總量為58.29%. 低海拔牦牛樣本中前3的菌群分別為瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-005)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-013)和克里斯滕森氏菌群(Christensenellaceae_ R-7_ group). 高海拔樣本中前3的菌群分別為瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-005)，瘤胃解纖維素菌屬(Cellulosilyticum)和 理研菌科胃腸菌群(Rikenellaceae_ RC9_ gut_ group)，數據顯示除瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-005)外，高低海拔牦牛腸道菌群屬OTU豐度各不相同，具體見表2.

表2 高、低海拔牦牛腸道菌群Top 30菌群豐度

從屬水平對前30種菌OTU的豐度分析顯示，高低海拔牦牛的腸道菌群有8個菌屬的差異比較顯著(P<0.05)，具體為：瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-013，OTU豐度低海拔8.48%，高海拔2.97%)、克里斯滕森氏菌群(Christensenellaceae_ R-7_ group，低海拔6.71%，高海拔3.68%)、氧化還原菌屬([Eubacterium]_oxidoreducens_ group，低海拔5.33%，高海拔1.58%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-014，低海拔4.63%，高海拔2.50%)、阿克曼菌屬(Akkermansia，低海拔2.27%，高海拔0.59%)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium，低海拔1.96%，高海拔0.49%)、難培養菌屬(uncultured_bacterium_o_Gastranaerophilales，低海拔1.62%，高海拔0.51%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-002，低海拔1.30%，高海拔0.42%). 低海拔區域牦牛腸道菌群OTU整體豐度較高海拔高，其中瘤胃球菌和氧化還原菌屬的OTU豐度比高海拔高2倍多.

4 討 論

腸道菌群種類的豐富性和多樣性對維持腸道微生態平衡起著重要作用[7]. 而生活在高、低海拔的牦牛腸道菌群的差異目前尚無報道. 牦牛正常的腸道菌群在進化過程中與宿主和環境相互適應且成動態平衡，容易受到食物、環境等因素的影響，加之腸道菌群數量較大，結構復雜，因此其研究存在一定難度. 隨著高通量測序技術的發展，使得16s rDNA測序成為研究腸道菌群的重要工具. 本研究采用16 s RNA高通量測序首次對高、低海拔兩種環境下的牦牛腸道菌群結構組成進行分析，發現低海拔和高海拔地區牦牛腸道菌群OTU數量分別為4 824個和4 237個，說明低海拔地區牦牛腸道菌群多樣性較高海拔地區牦牛腸道菌群多樣性更高，可能是因為低海拔地區植被更豐富，環境中細菌多樣性更高造成的.

在門水平上，高低海拔牦牛腸道菌群中最多的均為厚壁菌門(Firmicutes，OTU豐度低海拔69.38%，高海拔73.21%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，OTU豐度低海拔15.37%，高海拔14.56%)，這一研究與Guo等人(2015)對牛瘤胃微生物的菌群結構研究結果相似[8].

本研究顯示高低海拔牦牛腸道菌群存在較大差異，其中瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-013)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-014)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-002)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae_ R-7_ group)、氧化還原菌屬([Eubacterium]_oxidoreducens_ group)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、難培養菌屬(uncultured_bacterium_o_Gastranaerophilales)等差異顯著，低海拔地區牦牛腸道菌群中瘤胃球菌屬和氧化還原菌屬的OTU豐度比高海拔高2倍多. 瘤胃球菌是反芻動物胃中嚴格厭氧不運動的革蘭氏陽性菌，主要含白色瘤胃球菌和生黃瘤胃球菌兩類，廣泛分布于牦牛的瘤胃中[9]，是牦牛腸道中的優勢菌群，與牦牛消化功能有著密切的關系. 研究證實，瘤胃球菌產生的纖維素酶能夠吸附并降解植物細胞壁，有效提高牦牛消化高纖維植物的能力[10]. 本研究發現高海拔地區牦牛的腸道菌群中，瘤胃球菌豐度顯著低于低海拔地區牦牛. 若高海拔地區的牦牛向低海拔地區遷徙時，由于高海拔地區牦牛腸道內瘤胃球菌等優勢菌的豐度較低，高海拔地區牦牛腸道微生態短時間內無法適應低海拔的環境條件，可能導致牦牛對纖維素的消化不良，進而引起牦牛腹瀉. 這與Han等人發現的腹瀉的牦牛腸道菌群中瘤胃球菌明顯下降一致[11]. 事實證明，當高海拔地區的牦牛向低海拔地區引進時，牦牛常常會出現腹瀉的現象，可能與不同海拔地區牦牛腸道菌群結構組成差異有關，其具體原因及機制還需進一步研究.

我國2008年批準了16種微生物添加劑，乳酸菌、芽孢桿菌、酵母、雙歧桿菌、腸球菌、鏈球菌等均是名錄上微生物添加劑中的菌種，這些益生菌對維護動物腸道健康、緩解不良應激反應、改善畜舍環境、調節機體脂肪代謝、替代抗生素和改善畜產品品質有著重要的作用[12]. 在高海拔地區的牦牛向低海拔地區引進時，在牦牛的日糧中補充益生菌，是否有助于牦牛盡快適應低海拔地區環境需進一步研究. 另外，不同海拔地區牦牛的交流，可能有助于提升某一區域牦牛腸道菌群多樣性，本研究表明了高、低海拔牦牛腸道菌群結構存在較大的差異，為高海拔地區的牦牛向低海拔遷徙提供了微生態結構的參照，有利于牦牛飼養業、畜牧業探索不同海拔區域間牦牛的物種交流.