Bazedoxifene治療SLE小鼠的療效及對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群的影響

張瑩，代春燕,田吉來(lái)

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫科,江蘇 南京 210008;2.夏津縣人民醫(yī)院血液透析科,山東 德州 253200;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,整合醫(yī)學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,江蘇 南京 210023)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種主要累及女性尤其是育齡期女性的自身免疫性疾病，以自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物沉積和慢性炎癥引發(fā)細(xì)胞因子激活和組織損傷為特征。白細(xì)胞介素-6(IL-6)是調(diào)節(jié)免疫和炎癥的重要細(xì)胞因子，調(diào)控輔助T細(xì)胞(Th)1/Th2、Th17/Treg平衡，參與濾泡輔助T細(xì)胞(Tfh)輔助B細(xì)胞活化成熟[1]；IL-6和IL-6受體表達(dá)異常，與SLE疾病活動(dòng)相關(guān)，是治療SLE的潛在靶點(diǎn)[2-4]。同時(shí)，雌激素-雌激素受體(ER)-α和ER-β在誘發(fā)和加重SLE方面發(fā)揮一定的作用。雌激素通過(guò)ER-α參與T細(xì)胞和B細(xì)胞活化、炎癥和自身抗體產(chǎn)生[5]。

巴多昔芬(bazedoxifene,BAZ,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)是一種新型的第三代選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)，在不同的靶組織表現(xiàn)出雌激素的激動(dòng)或拮抗作用。例如，BAZ能促進(jìn)ER-α在子宮和乳房部位的降解，發(fā)揮抗雌激素作用；同時(shí)對(duì)骨骼系統(tǒng)的ER-β起到活化作用，從而增加脊椎與髖部的骨密度[6]。2013年BAZ被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療。2014年，Li等[7]利用計(jì)算機(jī)多配體同時(shí)對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)BAZ的吲哚部分和七元氮雜環(huán)擬似IL-6的Trp157和Leu57基團(tuán)，從而可與其受體gp130 D1區(qū)域進(jìn)行有效結(jié)合，發(fā)揮拮抗IL-6的作用。在隨后的細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)BAZ可通過(guò)抑制IL-6/gp130實(shí)現(xiàn)治療胰腺癌[8]、橫紋肌肉瘤[9]、結(jié)腸癌[10]、三陰性乳腺癌[11]的目的。

圖1 巴多昔芬的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

BAZ作用于ERs和gp130，具有治療SLE的可能性，本文擬利用MRL/lpr狼瘡小鼠，評(píng)估BAZ對(duì)SLE小鼠的治療作用及對(duì)脾臟CD4+T細(xì)胞亞群的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MRL/lpr小鼠(雌性，18周)購(gòu)自中國(guó)上海SLAC實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物有限公司，并在南京鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的無(wú)特定病原體(specific-pathogen-free,SPF)條件下飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在南京鼓樓醫(yī)院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的規(guī)程下進(jìn)行。醋酸巴多昔芬購(gòu)于江蘇正濟(jì)藥業(yè)股份有限公司。泊洛沙姆188(Kolliphor P188)購(gòu)于巴斯夫(中國(guó))有限公司。

1.2 藥物配制 稱(chēng)取醋酸巴多昔芬和泊洛沙姆188分別為4 mg和3 mg，溶解在1 mL去離子水中，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 給藥與動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組給予18周齡MRL/lpr小鼠(n=6)醋酸巴多昔酚20 mg·(kg·d)-1灌胃，對(duì)照組給予等濃度的泊洛沙姆188灌胃，均連續(xù)給藥4周。末次給藥后代謝籠收集小鼠24 h尿液，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白含量。小鼠摘眼球取血，分離血漿，用鼠抗dsDNA ELISA試劑盒(Shibayagi,日本)對(duì)血漿中dsDNA抗體水平進(jìn)行測(cè)定。麻醉處死小鼠，75%乙醇消毒腹部皮膚，切開(kāi)腹腔，取出脾臟和腎臟，稱(chēng)取濕重并記錄。根據(jù)下列公式計(jì)算小鼠脾臟指數(shù)。

脾臟指數(shù)=脾臟濕重(g)/小鼠體重(g)

1.4 分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞 脾臟稱(chēng)重后充分研磨，然后于200目篩網(wǎng)過(guò)濾制成單細(xì)胞懸浮液，1 300 r·min-1離心5 min，棄上清，加入10倍體積的紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解3 min，再用PBS充分洗滌次后重懸計(jì)數(shù)，將脾細(xì)胞以5×106mL-1的密度懸浮在含100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素，2 mmol·L-1谷氨酰胺和10%胎牛血清(GIBCO)RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。

1.5 流式細(xì)胞檢測(cè)脾臟CD4+T細(xì)胞亞群 為了鑒定Treg，取1×106個(gè)脾細(xì)胞加入FITC-anti-CD4室溫避光孵育15 min，對(duì)照管加入同型對(duì)照，PBS洗滌兩次后加入固定破膜劑200 μL，然后在4 ℃破膜1 h后，PBS洗一遍，加入anti-Foxp3-PE 4 ℃孵育30 min，PBS洗滌兩次后上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣本收集10 000個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)于Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群分析，取2×106個(gè)細(xì)胞種植于96孔板/孔，50 ng·mL-1phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)、1 μg·mL-1離子霉素和5 μg·mL-1布雷非德菌素A(BFA)刺激4 h。然后，F(xiàn)ITC-anti-CD4室溫避光孵育15 min；對(duì)照管加入同型對(duì)照，操作步驟同檢測(cè)管，PBS洗滌兩次后加入固定破膜劑200 μL，然后在4 ℃破膜1 h后，PBS洗一遍，加入APC-anti-IFN-γ(Th1)，PE-anti-IL4和(Th2)以及APC-anti-IL17A(Th17)4 ℃孵育30 min進(jìn)行標(biāo)記， PBS洗滌兩次后上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣本收集10 000個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。所有抗體、流式試劑均購(gòu)eBioscience(San Diego,CA,USA)。通過(guò)流式細(xì)胞儀(Calibur，BD Biosciences,CA,USA)獲取數(shù)據(jù)，并使用FlowJo軟件(Tree Star,USA)進(jìn)行分析。

1.6 腎臟的病理評(píng)估 處死小鼠后，切開(kāi)腹腔，去除包膜，取出腎臟，沿冠狀切面平均分開(kāi)，浸泡于冰PBS。4%低聚甲醛固定12 h以上，脫水，然后石蠟包埋，切成4 μm薄片。每只小鼠選取2張切片進(jìn)行蘇木精和曙紅(H&E)染色。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)200倍視野，按照Chan報(bào)道的評(píng)分方案[12]，對(duì)每個(gè)隔室(腎小球、間質(zhì))使用 0-4+量表，將病理分級(jí)為不存在、輕度、中度或重度的半定量方法對(duì)腎炎和血管炎的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)和損傷指數(shù)評(píng)分。

2 結(jié)果

2.1 BAZ有效緩解MRL/lpr小鼠狼瘡表型 與輔料對(duì)照組(vehicle,VEH)相比，BAZ治療組并沒(méi)有顯著降低小鼠的體重(P=0.1243，見(jiàn)圖2A)，但MRL/lpr小鼠脾臟指數(shù)顯著降低(脾重/體重,g·g-1)(P<0.05,見(jiàn)圖2B)?？闺p鏈 DNA(dsDNA)抗體是SLE的致病性抗體，但BAZ治療組抗dsDNA抗體的含量與對(duì)照組無(wú)顯著差別(P>0.05,見(jiàn)圖2C)。腎臟是SLE最易累及的重要臟器，腎臟損傷后臨床出現(xiàn)蛋白尿。與對(duì)照組相比，BAZ治療顯著降低SLE小鼠蛋白尿(P<0.01,見(jiàn)圖2D)。

A.MRL/lpr小鼠的體重；B.MRL/lpr小鼠脾臟指數(shù)；C.血清抗dsDNA抗體含量； D.24 h尿蛋白圖2 BAZ 顯著緩解MRL/lpr小鼠的狼瘡表型注：BAZ n=6,VEH(輔料組) n=6，*P<0.05，**P<0.01

2.2 BAZ減輕MRL/lpr小鼠腎臟損傷 我們進(jìn)一步分析BAZ治療對(duì)狼瘡小鼠腎臟損傷的影響。腎臟病理發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、系膜基質(zhì)出現(xiàn)彌漫性增生，腎間質(zhì)可見(jiàn)彌漫性炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，基本符合狼瘡腎炎的病理表現(xiàn)。而B(niǎo)AZ治療可顯著減低腎小球增殖(P<0.05,見(jiàn)圖3A、B)，減輕腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(P<0.05,見(jiàn)圖3A、C)。

2.3 BAZ調(diào)節(jié)MRL/lpr小鼠Th2/Treg平衡 CD4+T細(xì)胞亞群在SLE發(fā)病中發(fā)揮重要作用，Th1和Th17分泌炎癥因子，參與SLE重要臟器炎癥，Th2輔助漿細(xì)胞分化成熟參與自身抗體產(chǎn)生。本研究進(jìn)一步探討B(tài)AZ治療對(duì)狼瘡小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞亞群的影響。結(jié)果如圖4所示，BAZ顯著降低SLE小鼠脾臟Th2細(xì)胞比例(見(jiàn)圖4 C、D)，提高Treg比例(見(jiàn)圖4 G、H)，對(duì)Th1和Th17亞群沒(méi)有顯著影響(見(jiàn)圖4A、B、E、F)。

A.BAZ治療組和對(duì)照組狼瘡小鼠腎小球增生病變和腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；B.腎小球病理?yè)p傷指數(shù)；C.腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)圖3 BAZ減輕MRL/lpr小鼠腎臟損傷 注：*P<0.05，BAZ n=6,VEH n=6

A.Th1細(xì)胞;B.Th1占CD4+T細(xì)胞比例；C.Th2細(xì)胞；D.Th2占CD4+T細(xì)胞比例；E.Th17細(xì)胞；F.Th17占CD4+T細(xì)胞比例；G.Treg細(xì)胞；H.Treg占CD4+T細(xì)胞比例圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析BAZ治療組(圖A、C、E、G右列)和對(duì)照組(圖A、C、E、G左列)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞亞群 注：BAZ(n=6),VEH(n=6),*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，BAZ治療組MRL/lpr小鼠脾重指數(shù)顯著減小，有效減弱因Fas基因突變致淋巴細(xì)胞增生而出現(xiàn)的脾臟代償性肥大，說(shuō)明BAZ具有改善小鼠淋巴細(xì)胞功能紊亂，調(diào)整免疫功能的潛能。BAZ治療后，小鼠蛋白尿顯著較少，且能顯著緩解腎小球增生性病變，減輕腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示BAZ可以降低MRL/lpr小鼠重要臟器的炎癥損傷。

BAZ的治療作用可能與IL-6/gp130信號(hào)通路相關(guān)。IL-6可通過(guò)經(jīng)典信號(hào)(classic-signaling)或轉(zhuǎn)移信號(hào)(trans-signaling)分別與膜結(jié)合型 IL-6 受體(mIL-6R) 或可溶型IL-6 受體(sIL-6R)結(jié)合，均可觸發(fā)gp130 的二聚化，激活 JAK/STAT 信號(hào)通路從而表現(xiàn)出致病作用[12]。有報(bào)道SLE小鼠的血清 IL-6 升高及存在 IL-6R 的異常表達(dá)[13-15]。在其他小鼠品系中，外源性 IL-6 促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生，并加速腎小球腎炎的進(jìn)展[16]；阻斷 IL-6 或其受體可防止雄性小鼠的抗dsDNA抗體升高，減少蛋白尿并降低死亡率[17]。此外，SLE 患者血清 IL-6 水平升高[2-4,18-19]，與疾病活動(dòng)和抗 dsDNA 水平相關(guān)[3,18]。在體外，阻斷 IL-6 可抑制免疫球蛋白和抗 dsDNA抗體的產(chǎn)生，提高巨噬細(xì)胞通過(guò)自噬途徑降解[20]。SLE患者阻斷 IL-6Rs 會(huì)降低體內(nèi)B細(xì)胞和T細(xì)胞的活化[21]。評(píng)價(jià)IL-6單克隆抗體Sirukumab和IL-6R單克隆抗體托株單抗治療SLE的多中心臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行[22]。以上說(shuō)明抑制IL-6/IL-6R成為治療SLE的一項(xiàng)有效策略。

IL-6可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，通過(guò)促進(jìn)IL-4的自分泌，促進(jìn)Th2分化[23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BAZ顯著降低SLE小鼠脾臟Th2細(xì)胞的比例，可能與BAZ抑制了IL-6/gp130有關(guān)。IL-6可調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡[24]。目前認(rèn)為，Th17是自身免疫病發(fā)的關(guān)鍵角色，而Treg可抑制異常活化的效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)。IL-6聯(lián)合TGF-β可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Th17分化； 相反，IL-6可抑制TGF-β誘導(dǎo)的Treg分化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BAZ顯著提高Treg的比例，說(shuō)明了BAZ拮抗IL-6作用的可能性。盡管有報(bào)道IL-6可通過(guò)聚類(lèi)信號(hào)模式(cluster-signaling)激活初始T細(xì)胞gp130，使之分化為致病性的Th17 細(xì)胞[25]，本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BAZ對(duì)脾臟Th17的顯著影響。同樣，Anderson等報(bào)道BAZ治療膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎不影響Th17細(xì)胞的比例[26]。

BAZ的治療作用還不能避免與調(diào)節(jié)ERs相關(guān)。SLE具有顯著的性別趨向性，女性多見(jiàn)，尤其是育齡期女性。雌激素作用于ER-α 和ER-β，分別發(fā)揮促炎和抗炎的作用。SLE 患者組外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中ER-α mRNA 的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，SLE病情活動(dòng)組PBMC ER-α mRNA表達(dá)水平顯著高于病情緩解期組[27]。研究者Inui A 觀察到比健康對(duì)照相比，SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)-2K評(píng)分≥6的SLE患者外周血T細(xì)胞ER-β的表達(dá)量顯著降低；SLE患者PBMC ER-β-mRNA的表達(dá)水平與SLEDAI 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)[28]。雌激素驅(qū)動(dòng)Th1細(xì)胞應(yīng)答依賴(lài)于ER-α介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，在ER-α缺陷小鼠淋巴結(jié)中分泌IFN-γ的細(xì)胞減少[29]。同時(shí)ER-α通過(guò)與GATA3、Foxp3相互作用，可增加小鼠和人Th2、Treg的分化[30]。BAZ治療后顯著提高SLE小鼠脾臟Treg比例，減小Th2比例，可能和ER-α通路有關(guān)。

本研究初步證實(shí)BAZ治療小鼠SLE有效，可減少SLE小鼠脾重、蛋白尿，減輕腎臟損害，調(diào)節(jié)SLE小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞亞群。BAZ可能調(diào)控IL-6信號(hào)通路、ERs信號(hào)通路及作用機(jī)制有待更深入研究。