云南地區(qū)腎移植受者HLA基因分布頻率分析

蒲 丹，潘永圣，汪佳婕，許小靚，徐宏忍，趙云平，尹利民

昆明市第一人民醫(yī)院檢驗科，云南昆明 650011

腎移植是目前治療終末期腎病的最有效手段，隨著外科技術的成熟、圍術期管理方法的完善、組織配型的開展、免疫抑制劑的應用，我國腎移植術后1年移植腎存活率已達94.6%，5年存活率為87.5%[1]。影響移植腎長期存活的主要獨立危險因素是排斥反應[2]，而人類白細胞抗原(HLA)的匹配程度與急、慢性排斥反應均有關[3]。HLA基因具有高度的遺傳多態(tài)性，不同地區(qū)和種族基因分布頻率存在明顯差異[4]，因此，找到與腎移植受者HLA完全匹配的無關供者概率非常小。近年來關于腎移植受者HLA等位基因研究的相關報道較少，本研究對云南地區(qū)1 251例腎移植受者的HLA基因檢測數(shù)據(jù)進行了分析，以了解該地區(qū)HLA-A、B、DRB1和DQB1位點等位基因種類和分布頻率。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2020年11月在本院運用PCR聯(lián)合序列特異性寡核苷酸(SSO)探針技術進行HLA基因檢測的腎移植受者1 251例為研究對象，其中男857例，女394例，平均年齡(41±12)歲。所有受者進行HLA基因檢測前均未接受過任何移植手術。

1.2儀器與試劑 主要儀器：BIOER基因擴增儀(杭州博日儀器有限公司)，Luminex 200多功能流式點陣儀(美國Luminex公司)，Qbit4核酸濃度測定儀(美國賽默飛世爾公司)。 主要試劑：血液基因組DNA提取試劑盒(型號：DP348-02，北京天根生化科技有限公司)， HLA-SSO LABType分型試劑盒 (美國One Lambda公司)，Taq DNA聚合酶(上海普洛麥格生物產品有限公司)。

1.3方法 采集腎移植受者靜脈血2～3 mL至乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝真空采血管中，充分混勻，用血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用Qbit4核酸濃度測定儀檢測DNA濃度并調整至15～25 ng/μL。配制PCR反應體系：D-mix 13.8 μL，Primer 4.0 μL，DNA聚合酶0.2 μL，DNA 2.0 μL，終體積為20.0 μL。分別利用HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1和HLA-DQB1位點的不同引物進行擴增。PCR結束后，將產物變性、中和，分別加入4種寡核苷酸探針標記的微珠混勻，60 ℃雜交15 min。雜交結束后加入鏈霉親和素-PE染料進行染色，然后將雜交板轉移至 Luminex 200多功能流式點陣儀進行數(shù)據(jù)獲取，使用Fusion軟件進行結果分析，具體操作步驟參照試劑說明書。

1.4統(tǒng)計學處理 采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)分析。

2 結 果

2.1腎移植受者HLA-A位點等位基因分布頻率 HLA-A位點檢出等位基因17種，其中常見的等位基因是A*11、A*02、A*24，分布頻率較低的等位基因是A*66、A*69和A*74，見表1。

表1 腎移植受者HLA-A位點等位基因及分布頻率

2.2腎移植受者HLA-B位點等位基因分布頻率 HLA-B位點檢出等位基因31種，其中常見的等位基因是B*15、B*40、B*46，分布頻率較低的等位基因是B*45、B*59和B*65，見表2。

表2 腎移植受者HLA-B位點等位基因及分布頻率

續(xù)表2 腎移植受者HLA-B位點等位基因及分布頻率

2.3腎移植受者HLA-DRB1位點等位基因分布頻率 HLA-DRB1位點檢出等位基因14種，其中常見的等位基因是DRB1*12、DRB1*04、DRB1*09、DRB1*15和DRB1*08，分布頻率最低的等位基因為DRB1*06，見表3。

表3 腎移植受者HLA-DRB1位點等位基因及分布頻率

2.4腎移植受者HLA-DQB1位點等位基因分布頻率 HLA-DQ位點檢出等位基因7種，分別為DQB1*02、DQB1 0301、DQB1 0302、DQB1 0303、DQB1*04、DQB1*05和DQB1*06，7種等位基因均較為常見，其中DQB1 0301分布頻率最高，為0.286 6，DQB1 0302分布頻率最低，為0.061 2，見表4。

表4 腎移植受者HLA-DQB1位點等位基因及分布頻率

3 討 論

排斥反應是腎移植受者和移植腎存活的重要影響因素，HLA錯配數(shù)可影響腎移植受者術后排斥反應的發(fā)生[5]，但HLA系統(tǒng)具有高度多態(tài)性，找到HLA完全匹配的無關供者概率很低。1987年美國器官分配聯(lián)合網(wǎng)制定了強制性HLA 6抗原匹配腎臟分享政策，要求ABO血型相容和HLA 6抗原相配的腎臟在全國范圍內共享。按零抗原錯配標準選擇供受者的腎移植能夠獲得較為理想的近期和遠期腎存活率，但能夠達到6抗原無錯配的腎移植僅占2% ～5%。我國各移植中心供受者的樣本量小，能夠達到零抗原錯配標準的腎移植比例更低。因此，了解腎移植受者HLA不同位點的等位基因分布頻率具有重要意義，可為腎移植配型提供可靠的科學數(shù)據(jù)。

本研究對腎移植受者1 251例的HLA基因檢測數(shù)據(jù)進行分析，結果顯示，HLA-A位點等位基因分布頻率排在前3位的依次是A*11、A*02和A*24，頻率分別為0.314 5、0.280 2和0.193 0，如此高的等位基因頻率使找到相匹配的供者更加容易。PEI等[6]的研究結果顯示，A*11：01(0.321 2)、A*2：07(0.125 4)、A*24：02(0.120 1)等位基因分布頻率較高，與本研究結果較一致。馬錫慧等[7]的研究結果顯示，A2、A11和A24(9)抗原分布頻率較高，分別為0.305 9、0.178 3和0.156 8，與本研究有一定差異。各研究結果不一致的原因可能與樣本量不同、研究對象不同、地域不同等有關。ARNAIZ-VILLENA等[8]的研究報道，在白色人種、黑色人種和黃色人種中A*02、A*11和A*24分布頻率均較高，A*25、A*34、A*66和A*74等多種等位基因在黃色人種中未被發(fā)現(xiàn)。然而，本研究結果顯示，黃色人種也存在A*34、A*66和A*74等位基因，說明這幾種等位基因并非白色人種或黑色人種所特有，考慮可能與ARNAIZ-VILLENA等[8]的研究中納入的黃色人種例數(shù)較少或覆蓋的地域不同有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，昆明地區(qū)腎移植受者HLA-B位點是4個HLA位點中基因多態(tài)性最高的位點，因此在腎移植供、受者間匹配概率低于其他HLA位點。但有研究表明，HLA-B等位基因匹配不僅在移植腎長期存活中發(fā)揮重要作用，并且能降低晚期排斥反應的發(fā)生率[9-10]。本研究B*15、B*40和B*46分布頻率較高，與PEI等[6]針對南寧漢族人群的研究結果一致，與吳強駒等[11]針對中國北方漢族人群的研究有一定差異，考慮中國南方不同省份的人群基因多態(tài)性可能無明顯差異，但南、北方之間可能存在一定差異，也提示腎移植受者在尋找HLA相匹配的無關供者時應考慮地域差異。

研究表明，HLA-DRB1配型與早期排斥反應發(fā)生率呈高度相關性，HLA-DRB1位點錯配會降低移植腎的存活率[12]。RODRIGUES等[13]的研究結果顯示，HLA-DRB1等位基因錯配對移植腎長期存活的影響更大。本研究中，HLA-DRB1位點常見的等位基因是DRB1*12、DRB1*04、DRB1*09，與云南地區(qū)造血干細胞捐獻者HLA-DRB1位點最常見的等位基因一致[14],這提示腎移植受者找到相匹配的HLA-DRB1供者相對容易。

由于HLA-DR/DQ基因存在連鎖不平衡，早期的組織配型一般只包括HLA-A、B、DRB1位點，然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)HLAⅡ類抗體顯著影響移植腎的存活及功能[15]。LEE等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DQB1抗體在慢性排斥反應的發(fā)生及移植物功能喪失中發(fā)揮重要作用。鄭瑾等[17]研究發(fā)現(xiàn)，HLAⅡ類抗體出現(xiàn)頻率以HLA-DRB1、DQB1抗體較高，尤其是HLA-DQB1抗體的頻率在0.30～0.60，且大部分在0.50以上。HLA-DRB1抗體的頻率在0.10～0.30。分析發(fā)生抗體介導的排斥反應(AMR)患者的供體特異性抗體(DSA)發(fā)現(xiàn)，HLAⅡ類抗體出現(xiàn)的頻率高于HLAⅠ類抗體，尤其是HLA-DQB1抗體，因此，移植前HLA-DQB1位點的匹配非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DQB1位點等位基因均較常見，其中分布頻率最高的是DQB1 0301，其次是DQB1*05、DQB1*06，提示這幾種等位基因在腎移植供、受者間匹配概率較大。

綜上所述，腎移植受者HLA-A、B、DRB1和DQB1位點中，A*11、B*15、DRB1*12和DQB1 0301分別為分布頻率最高的等位基因，符合南方漢族人群HLA基因多態(tài)性分布特征。了解腎移植受者HLA基因分布情況將有助于更好地尋找HLA相匹配的無關供者。腎移植供、受者良好的HLA配型可以減少術后急性和慢性排斥反應的發(fā)生，降低腎移植受者對供者HLA的致敏性，減少術后新生DSA的產生，改善腎移植受者術后的生存質量，提高腎移植受者與移植腎的長期存活率。