染料木素脂質體的制備及其包封率和穩定性研究*

謝 琳，韋龍華，蔣雯麗，熊建文，易 慧，蔡錦源，崔 娜

柳州工學院食品與化學工程學院，廣西 柳州 545616

染料木素（GEN）屬于黃酮類化合物，化學名稱為4',5,7-三羥基異黃酮（C15H10O5），是主要從染料木、山豆根、大豆、槐角、大葉千金拔等植物提取出來的一種異類黃酮類化合物。染料木素幾乎不溶于水，溶于稀堿、乙醇等有機溶劑中。因其具有與雌性激素相似的化學結構，表現出雌激素樣活性和作用，故又稱為植物雌激素[1]。雌性激素刺激膠原蛋白等細胞外基質合成是其緩解皮膚老化、改善皺紋的主要機制[2]。此外還具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤等多種藥理活性。染料木素的天然資源富足，在大多數動物種類中表現出極低水平的毒性作用，被廣泛應用于化妝品、食品與保健藥用等領域[3]。染料木素是脂溶性藥物，它的口服試劑和注射試劑藥物利用率極低，如何提高藥物利用及其溶解度等內容已成為當今藥劑工作者們研究的熱門課題，但目前還沒有完善的關于染料木素脂質體制備的研究。

化妝品中的功能性成分必須透過角質層達到相應的作用部位，才能起到營養、改善皮膚狀況的作用，而人的皮膚的角質層具有極強的屏障作用，大分子的功能性成分難以通透。將功能性成分裝進脂質體囊泡中，由于脂質體與生物膜結構相似，功能性成分在脂質體的攜帶下經皮透過量增加。脂質體是將藥物包封于類脂質雙分子層的超微型球狀載體。脂質體由磷脂和膽固醇組成，可使脂溶性藥物易分散于水中，脂溶性藥物被脂質體包封后的構成具有靶向性、緩釋性和穩定性，且毒性低的新型藥物劑型[4-7]。自從脂質體應用于化妝品后，人們就開始探究它對于皮膚的效用。經實驗分析，它確實對肌膚具有效用，主要表現在以下幾個方面：提高功能性藥物的穩定性；使功能性藥物留在表皮與真皮之間，提高藥物利用率；保護肌膚的作用；對肌膚具有良好的保濕效果。目前制備脂質體的方法主要有乙醇注入法、逆向蒸發法、薄膜超聲分散法、超臨界CO2等[8]。文章采用薄膜超聲分散法制備染料木素脂質體。脂質體的配方組成會影響脂質體的結構，從而影響包封率，因此文章通過正交設計優化染料木素脂質體的配方，為染料木素脂質體在化妝品、食品、藥品中的開發提供參考依據。

1 試劑與儀器

試劑：卵磷脂、膽固醇（河南天興食品添加劑，食品級）；染料木素（中國食品藥品檢定研究所,純度＞98%）；“吐溫-80”（天津中和盛泰化工有限公司，食品級）；三氯甲烷、甲醇、鹽酸（西隴科學股份有限公司，AR級）。

儀器：JJ200電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；TDZ4-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；旋轉蒸發器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）；UV-1800紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；KQ5200DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；Nikon Eclipse E200光學顯微鏡（上海衡浩儀器有限公司）。

2 試驗方法

2.1 染料木素標準曲線的繪制

精確稱取染料木素1.6mg，放置于100mL容量瓶中用無水乙醇溶解并定容至刻度，得到染料木素標準溶液（16μg/mL），精確吸取1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL溶液并放置于10mL試管中，并用無水乙醇將體積調節至刻度，以無水乙醇作空白對照，在263nm處測取吸光度，以吸光度與標準濃度做標準曲線方程。

2.2 染料木素脂質體的制備

（1）溶劑及緩沖液制備：取70g甲醇于250mL燒杯中加入30g三氯甲烷，攪拌均勻，放置于棕色瓶中保存做溶劑。取30.285g Tris于250mL錐形瓶中加入200mL純水，再加20mL濃鹽酸，高溫高壓殺菌后，常溫保存，控制pH值約在7.20，做緩沖液。

（2）染料木素的制備：按劑量比稱取染料木素、大豆卵磷脂、膽固醇和“吐溫-80”放置于燒瓶中，加入三氯甲烷-甲醇（3∶7）混合溶劑溶解，在一定溫度下用旋轉蒸發儀除去有機溶劑（控制壓力在0.06MPa），直至燒瓶內壁形成一層干燥的薄層脂膜，繼續旋轉蒸發20min使脂膜完全干燥（控制壓力在0.10MPa），加入超過量三羥甲基氨基甲烷（Tris）-HCl（pH值為 7.20）生物緩沖液（控制壓力在0.02MPa）。繼續減壓蒸餾10min，超聲波冰水浴10min（控制溫度在10℃），重復3次，至體系均勻分散。

2.3 包封率的計算

總含量測定：取1mL脂質體于10mL試管中用無水乙醇定容至10mL進行破乳，取1mL破乳液稀釋至10mL，用紫外分光光度計于263nm處測定吸光度。

游離染料木素測定：取2mL脂質體放置于離心管中，在3000r/min下離心30min，取上清液0.1mL于10mL試管中并定容至10mL刻度，用紫外分光光度計于263nm處測定吸光度。

計算方法：包覆率=（產品中染料木素總含量-液體介質中游離的染料木素含量）÷產品中染料木素總含量。

2.4 單因素實驗

（1）溫度對包覆率的影響。加入0.8g大豆卵磷脂、0.4g染料木素、0.20g膽固醇、5mL溶劑、0.10g“吐溫-80”，改變溫度（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃），按2.3節制備并測定脂質體包封率。

（2）染料木素對脂質體的影響。加入0.80g大豆卵磷脂、0.20g膽固醇、5mL溶劑、0.10g“吐溫-80”、30℃，僅改變染料木素含量，分別使大豆卵磷脂∶染料木素質量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，按2.3節方法制備并測定脂質體包封率。

（3）膽固醇對脂質體的影響。加入0.80g大豆卵磷脂、0.40g染料木素、5mL溶劑、0.10g“吐溫-80”、30℃，僅改變膽固醇含量，分別使大豆卵磷脂:膽固醇為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，按第2.3節的方法制備并測定脂質體包封率。

（4）表面活性劑對脂質體的影響。加入0.8g大豆卵磷脂、0.4g染料木素、0.20g膽固醇、5mL溶劑、30℃，僅改變表面活性劑含量，使大豆卵磷脂∶表面活性劑質量比為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、8∶1，按2.3方法制備并測定脂質體包封率。

2.5 正交試驗

A表示大豆卵磷脂與膽固醇質量比，B表示大豆卵磷脂與染料木素質量比，C表示大豆卵磷脂與“吐溫-80”質量比。采用L9(34)正交試驗表進行正交試驗，如表1所示。

2.6 顯微鏡觀察

取適量的染料木素脂質體稀釋20倍，用吸管吸取，滴一滴于載玻片上，并用蓋玻片蓋住，用濾紙吸取多余水分置于顯微鏡下觀察脂質體形態。

2.7 染料木素脂質體穩定性研究

（1）染料木素脂質體熱穩定性測試。取染料木素脂質體，分為三組，放置于10mL試管中于4℃下3h，25℃下3h，37℃下3h和65℃下15min保存，并用紫外分光光度計測定吸光度。

（2）染料木素脂質體水解和貯存。制備三批脂質體，每批分為三組，于4℃各放一組避光保存，于1d、2d、3d、4d、5d測定pH值。取脂質體放置于4℃下，在4d內觀察包封率。

（3）染料木素脂質體氧化測試。制備0.25mol/L鹽酸200mL，加入硫代巴比妥酸0.75g，三氯乙酸30g，溶解并過濾取濾液，得到TTH試劑。取三批脂質體，每批分為三組，于4℃避光保存1d、2d、3d、4d、5d，各取1mL于10mL離心管中，加5mL TTH試劑，混勻，100℃水浴30min，冷卻后加TTH試劑定容，混勻，3000r/min離心5min，以TTH試劑為空白對照，取上清液在535nm處測定吸光度。

3 結果與分析

3.1 染料木素標準曲線

染料木素標準曲線如圖1所示。

圖1 染料木素標準曲線

3.2 單因素實驗

（1）溫度對脂質體包封率的影響如圖2所示。

圖2 溫度對脂質體包封率的影響

由圖2可知，隨著溫度的增加，包封率先增大后減小，最后居于平緩，在30℃達到最高。體系隨著溫度的升高，會導致大豆卵磷脂發生水解而使包封物滲漏，使得包封率降低，考慮到經濟性及產率，選擇30℃作為制備脂質體的溫度。

（2）染料木素添加量對脂質體包封率的影響如圖3所示。

圖3 染料木素添加量對脂質體包封率的影響

實驗中，大豆卵磷脂與染料木素比例分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1及5∶1，測定其包封率。結果表明，隨著染料木素添加量減少，包封率先增加后降低。當質量比為5∶1時，得到的包封率最低，且加入染料木素的量較少，脂質體中含有的量也較少，還浪費了大量的大豆卵磷脂和膽固醇壁材。當大豆卵磷脂與染料木素的質量比為3∶1時得到的包封率較高，且為93.11%。因此，選取1∶1、2∶1、3∶1作為正交試驗的三水平。

（3）膽固醇對脂質體包封率的影響如圖4所示。

圖4 膽固醇對脂質體包封率的影響

實驗中，大豆卵磷脂與膽固醇比例分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1及8∶1，測定其包封率。結果表明，隨著膽固醇添加量的減少，包封率先增加后減小。當大豆卵磷脂與膽固醇的質量比為2∶1時，脂質體中膽固醇的含量高使其嵌入雙分子層夾層的含量就高，導致囊泡夾層空間縮小，染料木素進入夾層的含量降低，因此包封率較低；而當膽固醇的含量較低時，磷脂脂膜的流動性大，包封的藥物易于滲漏，招致脂質體包封率低。當大豆卵磷脂與膽固醇的質量比為4∶1時所得到的包封率最高，且為92.60%，因此，選取大豆卵磷脂與膽固醇的質量比為3∶1、4∶1、5∶1作為正交試驗三水平。

（4）表面活性劑對脂質體包封率的影響如圖5所示。

圖5 表面活性劑對脂質體包封率的影響

該實驗在相同大豆卵磷脂用量、相同膽固醇用量及相同染料木素用量的條件下，考察“吐溫-80”加入量對脂質體包封率的影響。在實驗中，大豆卵磷脂與“吐溫-80”比例分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1及8∶1，測定其包封率，結果如圖5所示。結果表明隨著“吐溫-80”添加量的減少，包封率逐漸增大。因此，選取6∶1、7∶1、8∶1作為正交試驗的三水平。

3.3 正交試驗結果

正交試驗結果如表2所示。由表2可知,影響染料木素脂質體包封率的先后次序為A＞B＞C，根據均值可以得到染料木素脂質體的最優制備條件為A3B3C3，即大豆卵磷脂∶染料木素為3∶1，豆卵磷脂∶膽固醇大為5∶1，大豆卵磷脂與“吐溫-80”的比例為8∶1。方差分析表如表3所示。根據表3可知，大豆卵磷脂∶膽固醇質量比具有顯著性差異。

表2 正交實驗結果

表3 方差分析表

3.4 最優驗證

包封率驗證結果如表4所示。由表4可知，在染料木素脂質體最優的制備條件下，三次重復實驗包封率均在94%以上，平均包封率為95.14%。由此可知，實驗重復性良好，最優制備條件正確，所選工藝條件是可取的。

3.5 脂質體的形態

最優制備條件下的染料木素脂質體形態為橢圓球形，外觀完整，符合脂質體形態。其粒徑大多在200～300nm，屬于大單室脂質體，少部分粒徑達到1～2μm。有專家在離體人體腹部皮膚擴散實驗中CLSM技術發現粒徑超過600nm的普通脂質體不能將內容物傳遞到皮膚深層；而粒徑小于300nm時，可以實現內容物的皮膚深層傳遞；粒徑小于70nm時，可以在表皮和真皮內獲得最大的熒光度。由此可見制備的染料木素脂質體可以把染料木素傳遞到皮膚深層。該制備的脂質體可以運用在化妝品制劑中。

3.6 染料木素脂質體穩定性測試結果

（1）脂質體熱穩定性。儲存溫度對包封率的影響如圖6所示。

圖6 儲存溫度對包封率的影響

由圖6可知，染料木素脂質體的熱穩定性隨溫度的增高而降低，在65℃時破壁效果明顯，脂質體從95%降至75%，在常溫和消化溫度下脂質體也具有一定的破壁效應，只有在4℃時脂質體破壁不明顯，因此可見脂質體應儲存在低溫環境下。在4℃儲存染料木素脂質體10d，脂質體包封率變化不大，無明顯差別，維持在95%以上。因此，脂質體在4℃ 貯存是優良的，此時脂質體穩定性良好。

（2）脂質體的水解。脂質體膜材的水解反應使得脂質體中的膜材磷脂容易發生水解，脂質體制劑酸度通過磷脂的水解而增長，因此隨著酸度的改化，脂質體的pH值也會隨之變化[9]。儲存天數對pH值的影響如圖7所示。由圖7可知，脂質體溶液的pH隨著時間的推移緩慢降低，表明了脂質體正在水解，但在前面幾天脂質體水解緩慢，pH值未發生明顯變化。因此在制備脂質體時應制備高濃度的脂質體溶液，防止水解反應產生，影響脂質體包封率[10]。

圖7 儲存天數對pH值的影響

（3）脂質體的氧化。磷脂的氧化產物丙二醛可以與硫代巴比妥酸反應，在高溫下產生紅色的產物，該產物在535nm處有特殊吸收峰[11-13]。儲存天數與脂質體氧化的關系如圖8所示。由圖8可知，脂質體隨著時間的推移，氧化產物增加，氧化物與硫代巴比妥酸反應呈紅色。因此在儲存染料木素脂質體的時候應該密封儲存，防止脂質體過多與空氣接觸，使磷脂與氧氣反應[14]。

圖8 儲存天數與脂質體氧化的關系

4 結論

文章采用了薄膜分散法，將染料木素制備成脂質體。從配方組成、穩定性等方面研究了脂質體，最后得出以下結論：最優旋轉蒸發溫度為30℃，此時大豆卵磷脂∶膽固醇為5∶1，大豆卵磷脂∶染料木素為3∶1，大豆卵磷脂∶“吐溫-80”為8∶1；在最優的制備條件下得到的染料木素脂質體包封率為95.14%，粒徑為200～300nm，有的高達1000nm。通過測定脂質體穩定性得出，制備脂質體應先制備高濃度的脂質體溶液，并在4℃的溫度下儲存。