獨蒜蘭優質種苗快速培育研究

王躍華,陳 芳，鮮俊賢,宋沐航，高 首，張 旭

(1.成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610106；2.成都列五中學，四川 成都 610056)

0 引 言

獨蒜蘭是蘭科獨蒜蘭屬多年生半耐寒附生或地生珍稀植物[1].獨蒜蘭主要分布于我國的貴州、四川和云南等地，其假鱗莖半埋于苔蘚或枯枝落葉分解的有機質層中[2].獨蒜蘭植物的干燥假鱗莖為中藥材山慈菇,具有清熱解毒，消腫散瘀的功效[3-4]，內服可治肝癌、乳腺癌和子宮癌等，外用可治瘡毒、蛇蟲咬傷和皮膚燙傷及燒傷等.另外，獨蒜蘭作為蘭科植物，以其花形奇異、花色多樣而具有極高的觀賞價值[5]，已列入中國珍稀瀕危植物名錄中，是我國特有的二級珍稀瀕危保護植物.獨蒜蘭植物種子細小且無胚乳結構，其種皮的透氣和透水性也不太好，導致獨蒜蘭種子在自然界中萌發率極低.故本研究利用生物技術，從多個方面開展了提高獨蒜蘭種子萌發條件的研究.

1 材料與方法

1.1 材 料

獨蒜蘭植物蒴果采于四川省都江堰市龍池鎮，經四川師范大學生命科學院馬丹煒教授鑒定為蘭科獨蒜蘭屬獨蒜蘭植物.

1.2 方 法

1.2.1 不同基本培養基對獨蒜蘭種子萌發的影響

將經過0.05 mol/L次氯酸鈣浸種處理的獨蒜蘭種子分別接種在MS、1/2MS、1/4MS和B5基本培養基中，加入20 g/L蔗糖.以種子突破種皮為萌發標準，30 d后統計獨蒜蘭種子萌發率.

1.2.2 獨蒜蘭叢生芽增殖培養研究

選取帶頂芽的獨蒜蘭培養材料，在接入培養基前切除頂芽部分，采用L16(43)正交試驗設計，研究對獨蒜蘭植物叢生芽誘導增殖的影響見表1，本實驗采用的基礎培養基為B5+2 g/L活性炭+20 g/L蔗糖.

表1 水平因素表

1.2.3 獨蒜蘭無根苗生根壯苗研究

以1/2MS+ 2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+30.0 g/L蔗糖作為基礎培養基，添加不同濃度的6-BA(0.0、0.1、0.3、0.5mg/L)和IBA(0.0、0.1、0.2、0.3 mg/L)，培養60 d后統計獨蒜蘭無根苗的生根率和平均生根數.

1.2.4 數據計算公式

種子萌發率=(突破種皮的種子數/種子總數)×100%

叢生芽誘導率=(誘導出叢生芽的培養材料/接種的培養材料)×100%

產生叢生芽的平均數= 產生叢生芽的總個數/誘導出叢生芽的培養材料

生根率= (生根的無根苗數/接種的無根苗數)×100%

平均生根數= 生根總數/生根的無根苗數

5株獨蒜蘭組培苗平均鮮重：隨機秤取5株獨蒜蘭組培苗的重量

2 結果與分析

2.1 不同基本培養基對獨蒜蘭種子萌發的影響

本研究將處理后的種子接入不同基本培養基中，在培養溫度為(20±2)℃，光照強度為500～800 lx，光照時間24 h/d的條件下培養30 d后，統計實驗結果見表2.

表2 不同基本培養基對種子萌發的影響

由表2可以看出，在A1～A4中，以A4即B5基本培養基的種子萌發率最高為92 %；A3即在1/4MS培養基種子萌發率最低為79.33 %.綜上所述，B5培養基更有利于獨蒜蘭種子萌發，這與張麗娜等[4]對獨蒜蘭種子萌發研究結果一致，即B5培養基促進種子萌發和原球莖生長的優勢更明顯.黃永會等[5]在對云南獨蒜蘭進行種子萌發時，也確定B5培養基效果最佳.

2.2 正交試驗研究獨蒜蘭叢生芽誘導增殖

采用正交試驗設計，將切去頂芽的獨蒜蘭培養材料接入L16(43)正交試驗的培養基中，在溫度為(20±2)℃，光照強度為2 000～2 300 lx，光照時間為24 h/d的培養條件下，培養60 d后，統計試驗結果見表3，方差分析見表4.

表3 不同因素對叢生芽誘導增殖的影響

表4 方差分析表

由表3可知，不同因素對獨蒜蘭叢生芽誘導和增殖效果都不一樣.分別從叢生芽誘導率和平均產生叢生芽數兩個指標來看，編號12配方即A3B4C4的叢生芽誘導率最高為93 %，編號7配方即A2B3C3產生叢生芽平均數最高為7.63個.通過觀察發現，切除帶頂芽培養材料在接入編號12培養基后15 d，在材料的切口處出現明顯膨大，并開始愈傷化，隨著培養時間的增加，在愈傷化的組織表面開始長出淺綠色的多個小芽點，隨后芽點逐漸長大，可形成帶有2～3片小葉的無根幼苗.

通過極差分析3個因素對叢生芽的誘導率影響大小分別為A>C>B，即TDZ的影響最大的，肌醇次之，KT影響最??；進一步根據各水平的均值大小，篩選出了叢生芽誘導的最佳組合為A3B2C4，即為B5+TDZ 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+200.0 mg/L肌醇+2.0 g/L活性炭+20 g/L蔗糖.通過進一步驗證實驗，獲得叢生芽誘導率在培養60 d后可達到98.00%，平均產生叢生芽數達到6.80個.

通過極差分析3個因素對產生叢生芽的平均數影響大小依次為A>B>C，即TDZ的影響最大的，KT影響次之，肌醇影響最?。贿M一步根據各水平均值大小，確定了叢生芽數增殖的最佳組合為編號7配方，即A2B3C3.

根據表4方差分析結果可知，對叢生芽誘導率，因素A即TDZ達到了極顯著水平，因素C即肌醇達到了顯著水平，說明TDZ因素對叢生芽誘導率影響最大，其次是肌醇，影響最小的因素是KT.根據Duncan檢驗結果表明，TDZ對叢生芽誘導率影響最大的是水平3，即濃度為2.0 mg/L，肌醇影響最大的水平為4，即濃度為200.0 mg/L.

對產生叢生芽的平均數，因素A即TDZ達到了極顯著水平，因素B即KT達到了顯著水平，根據Duncan檢驗結果表明，TDZ對增加叢生芽平均數影響最大的水平為2,即濃度為1.0 mg/L ，KT影響最大的水平為3，即濃度為1.5 mg/L.

由此可見，方差分析的結果與極差分析結果是一致的，說明TDZ、KT和肌醇對于叢生芽誘導和增加叢生芽數都具有重要的作用.

綜上，本研究選擇A3B2C4，即為B5+TDZ 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+200.0 mg/L肌醇+2.0 g/L活性炭+20.0 g/L蔗糖作為獨蒜蘭叢生芽誘導增殖最佳配方.

2.3 獨蒜蘭無根苗生根壯苗研究

切取叢生芽上生長長度為2.0～3.0 cm的無根苗(見圖1)，接入1/2MS+ 2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+30.0 g/L蔗糖作為基礎培養基，并添加不同植物生長調節劑的配方中，在溫度為(20±2)℃，光照強度為1 800～2 100 lx，光照時間12 h/d的條件下，培養60 d，統計實驗結果見表5.

圖1 獨蒜蘭叢生芽

表5 不同植物生長調節劑對無根苗生根壯苗的影響

續 表

由表5可知，在B1組不添加任何植物生長調節劑的培養基中，其無根苗的生根率和平均生根數都是較低的，即生根率為64.67%、平均生根數1.83條，并且測得獨蒜蘭組培苗的重量也是最輕的，即5株獨蒜蘭組培苗的平均鮮重僅為7.60 g；在B2～B4組中，即6-BA濃度保持在0.1 mg/L，IBA濃度由0.1 mg/L上升到0.3 mg/L時，其生根率、平均生根數和平均鮮重都呈現出先升高后降低的變化，其中以B3組，即當在6-BA濃度為0.1 mg/L、IBA濃度為0.2 mg/L時，其生根率、平均生根數和平均鮮重都是最高，即生根率為100 %，平均生根數為3.20條、5株獨蒜蘭組培苗的平均鮮重為21.11 g；在B10組中，當培養基中植物生長調節劑濃度都升到最高，即6-BA濃度為0.5 mg/L，IBA濃度為0.3 mg/L時，生根率和平均生根數卻都是最低，即生根率僅為61.67%,平均生根數僅為1.73條.

綜上所述，獨蒜蘭的最佳生根壯苗培養基為1/2MS+IBA 0.2 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+20.0 g/L蔗糖，培養60 d后，其獨蒜蘭植株的生根率為100.00%，平均生根數為3.20條，平均鮮重為21.11 g，見圖2.

圖2 獨蒜蘭組培苗

3 討 論

蘭科植物在利用生物技術快速繁殖培養過程中，大多數會采用根狀莖增殖，極少會形成類似愈傷組織的結構[6].陳進勇等[7]用惠蘭和墨蘭種子進行培養時，在植物生長調節劑的作用下通過誘導愈傷組織形成，進一步分化出芽.TDZ是苯基脲型的細胞分裂素，可以去除頂端優勢，誘導形成叢生芽或者側芽[8].張月琴等[9]發現4.0 mg/L TDZ處理可以使小麥幼胚莖尖誘導形成叢生芽.本研究采用了較高濃度的TDZ培養去掉了頂芽的獨蒜蘭培養材料，結果發現培養材料在愈傷化的基礎上，可進一步誘導產生出叢生芽，這與文獻[10]的研究結果一致.

在誘導培養叢生芽過程中，添加一定濃度的肌醇物質，對獨蒜蘭植物組織細胞快速生長有促進作用.劉寶光等[11]在紅皮云杉的胚性愈傷組織的增殖培養中，通過添加適當濃度的肌醇，可誘發紅皮云杉早期原胚的形成.另外，肌醇還是植物抗逆環境生長的關鍵因子，在某些植物細胞程序死亡的過程中，有發揮信號分子的作用[12].

生根壯苗是完成獨蒜蘭優質種苗培育至關重要的一步.本研究通過對基本培養基和植物生長調節劑的研究，獲得了獨蒜蘭生根壯苗的最佳培養基為1/2MS+IBA 0.2 mg/L +6-BA 0.1 mg/L+2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+20.0 g/L蔗糖.此研究成果可為工廠化生產獨蒜蘭優質種苗提供重要的技術支撐，在一定程度上可緩解獨蒜蘭植物資源嚴重短缺的難題.