不同氮效率紫花苜蓿葉特征及其產量效應研究

王 靜， 劉曉靜， 程甜甜， 童長春， 汪 雪

(甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心, 甘肅 蘭州 730070)

植物的葉是植物生產過程中進行光能轉換的場所和光合產物的重要載體。研究表明，植物95%以上的干物質來源于葉的光合作用，葉特性直接影響著光合產物的積累，進而影響其產量和品質[1]。近年來，關于植物葉特征與生產特性關系的研究也在不斷深入，在對水稻(Oryzasativa)和小黑麥(Triticalewittmack)的研究中發現葉面積對作物產量和品質有顯著影響[2-3]，葉面積的增大，擴展了作物的光合場所，從而提高其光合能力，積累較多的有機物。研究還表明，葉片數[4]、葉莖比[5]、葉重[6]、比葉重[7]等葉片外部特征與作物生產性能密切相關，葉片內部輸導組織維管束數目和大小也對產量起決定作用[8]。在牧草生產中光能利用的諸多因子中葉面積對產量的貢獻最大，這是因為葉面積不僅是指征群體冠層結構的重要指標之一，更是以收獲營養體為目標的牧草作物產量的重要構成因子，可直接影響牧草的產量及品質，因而其對產量的貢獻較大[9]。氮效率指的是植物對氮素的固定、吸收和轉化能力的綜合體現[10]。研究認為，作物氮效率因其品種的形態特征及生理特性不同而異，植物氮高效主要表現在：葉片光合效率高[11],根系吸氮能力強[12-13],氮素積累與干物質生產較一致，地上和地下部生長協調[14-15],氮同化酶基因高效表達[16-17]等方面，可見，葉特性對植物氮效率至關重要。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為世界上栽培最早、分布最廣的多年生豆科牧草，由于其具有獨特的氮素利用方式，與禾谷類作物相比可以大大提高粗蛋白質的產出，所以紫花苜蓿成為了畜牧業生產中不可或缺的優質植物性蛋白飼料。在以收獲營養體為目標的牧草生產中，葉是其產量構成的重要因素，因此，紫花苜蓿葉特性越突出，其產量就越高，品質也越好，因而氮積累量也越高，蛋白生產量就越大[18-19]。在存在氮效率差異的紫花苜蓿品種間，因其氮素吸收利用能力的差異，紫花苜蓿對氮肥的響應不同，氮肥報酬率差異極顯著[20]，干物質積累與氮積累均存在差異[21]。為此，本研究以紫花苜蓿氮效率差異品種為研究對象，通過對不同氮效率紫花苜蓿葉形態和營養特征及其輸導組織的解剖結構展開探討，以期明確不同氮效率紫花苜蓿葉特征差異及其產量和品質效應，為進一步深入開展紫花苜蓿氮效率差異機制研究提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取4個不同氮效率紫花苜蓿品種(紫花苜蓿品種是由本團隊前期研究篩選所得的4種不同氮效率類型)：‘LW6010’(氮高效型)，‘甘農3號’(氮常效型)，‘甘農7號’(氮反效型)和‘隴東苜蓿’(氮低效型)。紫花苜蓿品種均由甘肅農業大學草業學院提供；供試肥料為：氮肥使用蘭州化學工業公司生產的尿素CO (NH2)2(N≥46%)；磷肥使用金昌奔馬復合肥有限責任公司生產的Ca (H2PO4)2(P2O5≥12%)。

1.2 試驗設計

1.2.1試驗地概況 試驗地位于甘肅農業大學，地理位置為北緯36°03′，東經103°40′，海拔高度為1 525 m，屬中溫帶大陸性氣候，日照多，氣候干燥，晝夜溫差大，年均溫10.3℃，年平均降水量為360 mm，主要集中在7，8，9三個月內，年均蒸發量1 410 mm，年日照數平均2 600 h，無霜期180 d以上。試驗地土壤概況如表1所示。

表1 土壤理化性狀

1.2.2試驗設計 本試驗采用二因素(紫花苜蓿品種、施氮量)裂區試驗設計，紫花苜蓿品種是4種不同氮效率類型，施氮量為0和103.5kg·hm-2(純氮)兩個氮水平，分別記為N0和N103.5，共8個處理，每個處理3次重復，共24個小區，每個小區面積為12 m2(3 m×4 m)，每個小區之間以50 cm小田埂分開，種植總面積為288 m2。磷肥作為底肥一次性施入，施用量為900 kg·hm-2，氮肥的施用量為225 kg·hm-2，分別于播種前、返青期和每次刈割后施入，施肥后充分灌溉。本試驗于秋天進行播種(8月18日)，播種前種子經根瘤菌液浸種，播種量為15 kg·hm-2，播種深度為2～4 cm，人工條播，行距20 cm。初花期刈割進行指標的測定，于種植第2年進行刈割(5月15日、6月26日、8月11日、10月5日)，共刈割4茬。除施肥不同外，其余田間管理均相同。

1.3 測定指標及方法

每小區分別選取30株代表性的植株并從每株中隨機選取一單枝，莖葉分離，分別測其鮮重、葉片數、葉面積，之后放入105℃的烘箱中殺青15 min，在85℃下烘干至恒重，測其葉干重、葉莖比等。其中葉面積用葉面積儀(CI-202型，美國CID公司)測量。根據以上數據計算出比葉重、葉莖比，計算公式如下：比葉重(g·cm-2)=葉干重/葉面積；葉莖比=葉干重/莖干重。

輸導組織解剖結構：紫花苜蓿返青后15 d(苗期)取同一部位的葉片為材料，立即放入福爾馬林-乙酸-乙醇(Formalin-aceto-alcohol，FAA)混合溶液中固定24 h備用。以石蠟切片技術為基礎[22]，采用LEICA全自動切片機(德國)代替傳統方法制作高精度切片，使用Carl Zeiss型萬能顯微攝像光學顯微鏡(德國)實現同期拍照、并利用Axio-Vision型圖像分析系統(德國)采集數據。每處理選取3個樣本，每個樣本隨機取10個視野。

產量(kg·hm-2)：刈割后測定各小區鮮草產量。同時，分別取樣500 g自然風干至恒重，計算鮮干比，折算干草產量。用莖葉比和干草產量折算出葉產量，可計算出葉增量，計算公式如下：葉增量(g·m-2·d-1)=葉產量/天數。

蛋白含量：采用H2SO4-H2O2法消煮后，用凱氏定氮法測定[23]。蛋白積累總量(kg·hm-2)=刈割干草產量(kg·hm-2)×蛋白含量(%)[22]。

酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)：采用Van Soest法測定[20]。

1.4 數據統計與分析

本研究采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。采用單因素(One-way ANOVA)和Duncan法進行方差分析和多重比較(α=0.05)，用Pearson法對產量和葉特性各指標進行相關分析。通過標準化回歸系數的方法[9]計算通徑系數，并將相關系數分解為直接通徑系數與間接通徑系數的代數和，可直觀反映葉特征各因子對產量的效應。用Excel 2010軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同氮效率紫花苜蓿葉的特征

2.1.1葉重、葉面積 由表2可知，4個紫花苜蓿品種中，不施氮和施氮處理時‘LW6010’的葉重在第2茬和第4茬顯著高于‘隴東苜蓿’，葉面積在各茬均顯著高于‘隴東苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘甘農3號’的葉重在各茬均顯著提高，‘LW6010’和‘甘農3號’的葉面積除第1茬外均顯著提高(P<0.05)。

2.1.2比葉重、葉片數 本研究中，在不施氮和施氮處理下，‘LW6010’的比葉重和葉片數在各茬均顯著高于‘隴東苜蓿’(P<0.05)；施氮后，‘甘農3號’的比葉重除第2茬外均顯著提升，葉片數在各茬均顯著提升(P<0.05)(表3)。

表3 不同氮效率紫花苜蓿比葉重和葉片數

2.1.3葉增量、葉莖比 4個紫花苜蓿品種在不同氮水平下，‘LW6010’的葉增量在第1茬和第4茬顯著高于‘隴東苜蓿’，葉莖比除第4茬外均顯著高于‘隴東苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘甘農3號’的葉增量除第3茬外均顯著提高，葉莖比在各茬均顯著提高(P<0.05)(表4)。

表4 不同氮效率紫花苜蓿葉增量和葉莖比

2.1.4葉輸導組織解剖結構 與‘隴東苜蓿’(圖1-D,H)相比，在相同氮水平下‘LW6010’(圖1-A,E)維管束面積大，木質部區域寬廣，導管數目多，主脈凸起明顯，且維管束、韌皮部、木質部面積和導管數量均顯著高于‘隴東苜蓿’(P<0.05)(表5)。此外，與不施氮相比，在供氮103.5 kg·hm-2時，‘LW6010’(圖1-E，表5)的維管束、韌皮部、木質部面積和導管數量，增幅分別為28%，21%，27%和33%，而‘隴東苜蓿’(圖1-H，表5)各增幅分別為20%，17%，18%和15%(表5)。

表5 不同氮效率紫花苜蓿葉輸導組織解剖結構

圖1 不同氮效率紫花苜蓿葉輸導組織解剖結構

2.1.5葉營養特性 4個紫花苜蓿品種中，不施氮和施氮均表現為‘LW6010’的葉蛋白含量顯著高于‘隴東苜蓿’，葉蛋白積累總量除第1茬外均顯著高于‘隴東苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘LW6010’和‘甘農3號’的葉蛋白積累總量除第2茬外均有顯著提高(P<0.05)(表6)。

表6 不同氮效率紫花苜蓿葉蛋白含量和葉蛋白積累總量

2.2 不同氮效率紫花苜蓿的生產性能

2.2.1產量 由表7可知，4個紫花苜蓿品種中，在不施氮和施氮時均表現為：‘LW6010’的總產量顯著高于‘隴東苜蓿’(P<0.05)。隨著氮肥的施入，‘LW6010’、‘甘農3號’和‘甘農7號’的總產量均顯著上升(P<0.05)。

表7 不同氮效率紫花苜蓿的產量

2.2.2粗蛋白含量 本研究中，4個紫花苜蓿品種在不施氮和施氮均表現為：‘LW6010’的粗蛋白含量在第4茬顯著高于‘隴東苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘LW6010’的粗蛋白含量除第4茬外均顯著升高，‘甘農3號’、‘甘農7號’和‘隴東苜蓿’的粗蛋白含量在各茬均顯著升高(P<0.05) (表8)。

表8 不同氮效率紫花苜蓿粗蛋白含量

2.2.3酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維 4個紫花苜蓿品種中，不施氮和施氮時‘LW6010’的ADF在第3茬和第4茬顯著低于‘隴東苜蓿’，NDF除第4茬外均顯著低于‘隴東苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘LW6010’、‘甘農3號’和‘隴東苜蓿’的NDF顯著下降(P<0.05)。

2.3 紫花苜蓿葉特征因子的產量效應

由表9可知，‘LW6010’、‘甘農3號’、‘甘農7號’和‘隴東苜蓿’葉特征各因子對產量直接效應分別依次為：葉面積(0.264)>葉重(0.241)>葉片數(0.220)>葉增量(0.216)>比葉重(0.169)>葉莖比(0.026)；葉重(0.339)>葉面積(0.311)>葉片數(0.229)>比葉重(0.170)>葉莖比(0.062)>葉增量(0.028)；葉重(0.428)>葉面積(0.355)>葉片數(0.117)>比葉重(0.075)>葉增量(0.074)>葉莖比(0.026)；葉重(0.334)>葉面積(0.331)>葉片數(0.158)>葉增量(0.152)>比葉重(0.149)>葉莖比(—0.068)。

表9 不同氮效率紫花苜蓿ADF和NDF

表10 不同氮效率紫花苜蓿葉特征因子對產量的直接及間接效應

3 討論

3.1 不同氮效率紫花苜蓿葉特征差異

以營養體為收獲目標的牧草中，葉特征對其生產性能的影響非常重要。在本研究中發現，無論氮水平高低，紫花苜蓿的葉特征在4個不同氮效率品種間均存在差異。其中，氮高效紫花苜蓿品種‘LW6010’的葉特征綜合表現最好，‘隴東苜蓿’葉特征綜合表現最差，前人通過對煙草(Nicotianatabacum)、小麥(Triticumaestivum)、水稻等的研究也發現葉莖比、葉面積、比葉重等葉特征在不同氮效率類型間存在差異[24-26]。除葉片生長特性外，葉特征的差異還體現在內部結構上，比如輸導組織。植物的輸導組織是用來運輸水分和養分的，韌皮部和木質部作為植物三大輸導組織之一，通常負責將植物光合作用所產生的有機物輸送到生長旺盛的組織和器官中[27]，因此維管束的生長發育情況和導管數量必然會影響植物對養分的吸收和利用。本研究中，‘LW6010’的維管束面積、韌皮部面積、木質部面積最大，導管數量最多，且顯著高于‘隴東苜蓿’，因此‘LW6010’葉片生長較好。同時‘LW6010’輸導組織發育較佳，具有較高的氮營養吸收、運輸及轉化能力，這也是‘LW6010’具有氮營養高效特征的原因之一。此外，蛋白含量是決定飼料品質的重要指標，紫花苜蓿收獲的主要是莖葉等營養體，其葉片的營養特性在很大程度上決定著牧草的產量和品質。本研究中，‘LW6010’葉蛋白含量和葉蛋白積累總量高于其他品種，葉營養品質更好，氮營養效率更高。氮積累主要是以蛋白總量的形式體現，因此，營養品質與氮素吸收利用效率密切相關。崔文芳等[28]通過對不同氮效率高產玉米(Zeamays)的研究發現在同一氮素水平下，高效型雜交種吐絲期穗三葉含氮量均高于低效型，王小純等[29]和姜瑛等[30]在小麥的研究中均表明氮肥利用率高的小麥品種其葉片氮含量高于氮肥利用率低的品種。總之，氮高效紫花苜蓿品種‘LW6010’葉特征表現優于‘隴東苜蓿’，而‘甘農3號’和‘甘農7號’則介于二者之間。由此可見，不同氮效率紫花苜蓿的葉特征存在差異，紫花苜蓿葉特性是體現其氮高效的重要特征。

3.2 紫花苜蓿葉特征因子對產量的影響

紫花苜蓿是以收獲營養體為目標，因此其葉特征與產量關系非常密切，有研究表明葉片對紫花苜蓿產量的貢獻能達到30%～60%[31]。本研究中采用通徑分析法得出4個不同氮效率紫花苜蓿品種的葉特征各因子對產量的直接效應表現為葉重和葉面積對產量的貢獻最大，這是因為葉重是以收獲營養體為目標的飼草重要構成因子，可直接決定紫花苜蓿的產量，因而對其產量的影響最大，已有研究也證實產量與葉重成極顯著正相關關系[6]。葉面積因其是評價植物生長狀況的重要參數而與產量密切相關，是植物進行估產的重要指標之一，因此足夠的葉面積是產量的保證[2,32]，一般葉面積高的品種，產量也相對較高[33]。另外，葉片數也是影響產量的重要因子之一，這是因為適當增加葉片數，能使光合葉面積增大，有利于紫花苜蓿積累較多的有機物，進而增加產量[34]。

4 結論

紫花苜蓿的葉特征在不同氮效率品種間均存在差異，并且紫花苜蓿的葉特性是體現其氮高效的重要特征，無論環境氮水平高低，氮高效紫花苜蓿品種‘LW6010’葉特征綜合表現總是優于‘隴東苜蓿’，‘甘農3號’和‘甘農7號’葉特征綜合表現則介于前二者之間。

利用通徑分析發現，紫花苜蓿葉特征各因子中葉面積和葉重的產量效應最突出。